miR166a及靶基因LMBR1在百合体胚发育及形态建成中的功能研究
发布时间：2021-01-11 23:06
百合观赏性强、商业价值高,是在国际领域占有重要地位的球根花卉,但其种球繁殖和种质创新还存在许多问题需要解决。体细胞胚发生具有繁殖系数高、变异率低等诸多优点,是有望解决上述问题的有效途径,但百合体胚发生的分子机制尚不明确。本课题组前期研究表明miR166a在百合体胚发生过程中差异表达,但其靶基因LpLMBR1的功能在植物中尚未见报道。为探索lpu-miR166a及其靶基因LpLMBR1在百合体胚发生及形态建成中的功能,本研究克隆了细叶百合（Lilium pumilum DC.Fisch）miR166a初级体（lpu-pri-miR166a）及其靶基因LpLMBR1完整CDS区域,并进行了生物信息学分析。借助于课题组建立的百合稳定高效遗传转化体系,通过基因过表达、敲除及沉默等技术,初步明确了 miR166a在百合体细胞胚发生及形态建成中的作用,首次在植物中探讨了LpLMBRl的功能。主要研究结果如下:1.克隆得到LpLMBRl完整CDS序列;LpLMBRl编码蛋白为疏水性蛋白,位于胞外,是膜的固有组成成分,起着细胞连接的作用;LpLMBR1在细叶百合的叶片、根和鳞片中特异性表达,其中叶片中...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
左pRI101-ON载体，右pRI101-ON载体多克隆位点Fig.2-1LeftimagepRI101-ONvector,RightimagepRI101-ONvectormulti-clonebit
2lpu-miR166a初级体、LpLMBR1的克隆及生物信息学分析13挑选生长健壮的4-5周的本氏烟草，用1mL注射器吸取重悬菌液，由烟草叶片下表皮轻轻注射，直至菌液充满整个叶片，暗培养2d后光培养1d，用激光共聚焦显微镜直接观察叶片的荧光情况。2.2结果与分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由图2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR扩增片段大小在500bp左右，与预期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，测序结果表明PCR产物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息学分析测序结果表明lpu-pri-miR166a为501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查找其他物种的pre-miR166a序列。经过比对发现，lpu-pri-miR166a片段中miR166前体与芦笋的miR166的前体相似度可达98%、茶树95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase数据库（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前体序列，包括：芦笋、水稻、茶树、毛果杨、柑橘以及模式作物拟南芥、烟草和观赏性作物海棠、向日葵。将查询得到的miR166a前体与细叶百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp图2-2（左）lpu-pri-miR166a扩增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12图2-3miR166a前体序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
2lpu-miR166a初级体、LpLMBR1的克隆及生物信息学分析13挑选生长健壮的4-5周的本氏烟草，用1mL注射器吸取重悬菌液，由烟草叶片下表皮轻轻注射，直至菌液充满整个叶片，暗培养2d后光培养1d，用激光共聚焦显微镜直接观察叶片的荧光情况。2.2结果与分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由图2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR扩增片段大小在500bp左右，与预期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，测序结果表明PCR产物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息学分析测序结果表明lpu-pri-miR166a为501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查找其他物种的pre-miR166a序列。经过比对发现，lpu-pri-miR166a片段中miR166前体与芦笋的miR166的前体相似度可达98%、茶树95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase数据库（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前体序列，包括：芦笋、水稻、茶树、毛果杨、柑橘以及模式作物拟南芥、烟草和观赏性作物海棠、向日葵。将查询得到的miR166a前体与细叶百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp图2-2（左）lpu-pri-miR166a扩增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12图2-3miR166a前体序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
【参考文献】：
期刊论文
[1]龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析[J]. 张清林,苏立遥,厉雪,张舒婷,徐小萍,陈晓慧,王培育,李蓉,张梓浩,陈裕坤,赖钟雄,林玉玲. 园艺学报. 2018(08)
[2]Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制[J]. 张敏,朱明,李文宗,马洁,刘悦萍,江海洋,王磊,徐妙云. 中国农业科学. 2017(16)
[3]植物根的作用[J]. 孙映萱. 好家长. 2017(33)
[4]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[5]烟草microRNA171c的功能分析[J]. 张力,沙爱华. 植物科学学报. 2016(05)
[6]百合等球根花卉育种研究进展[J]. 肖海燕,刘青林. 中国农业科技导报. 2015(06)
[7]玉米MIR166基因家族的进化与功能研究[J]. 王艳芳,赵彦宏,刘林德,周瑞莲. 南方农业学报. 2015(08)
[8]植物体细胞胚胎发生影响因素研究进展[J]. 蔡正旺,刘静,杨松杰. 安康学院学报. 2014(04)
[9]MIR166基因家族在陆生植物中的进化模式分析（英文）[J]. 赵旭耀,陈斯云,赵磊,张雪梅,马朋飞,郭振华. 植物分类与资源学报. 2014(03)
[10]百合花特异启动子PchsA表达载体的构建及功能分析[J]. 常小丽,刘雅莉,王跃进,徐伟荣,张宗勤. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2009(02)
博士论文
[1]百合VIGS体系的建立及LhDTX35基因的克隆和功能研究[D]. 徐华.中国农业科学院 2018
[2]小麦不同生长发育时期miRNA的鉴定及2个穗/籽粒高表达miRNA功能的初步研究[D]. 简超.西北农林科技大学 2017
[3]过表达LaMIR166a在落叶松ESMs成胚发育及其萌发过程中的功能研究[D]. 李哲馨.中国林业科学研究院 2017
[4]落叶松IAA受体基因分离与干细胞极性相关miR166及其目标基因功能研究[D]. 李水根.中国林业科学研究院 2013
硕士论文
[1]细叶百合2型金属硫蛋白（LpMT2）基因的克隆及其功能解析[D]. 赵婧竞.东北林业大学 2019
[2]利用STTM技术分析拟南芥miR160和miR165/166的互作网络及玉米miR166的初步功能[D]. 杨天啸.河南农业大学 2019
[3]百合单萜合成酶基因多态性研究和功能验证[D]. 樊俊苗.山西农业大学 2018
[4]百合体胚发生过程中miR166及其靶基因的鉴定与表达分析[D]. 杨越.沈阳农业大学 2017
[5]垂花百合花青素基因 ANS 启动子的克隆及功能分析[D]. 阴婷.沈阳农业大学 2016
[6]miR165/166对番茄形态建成的调控及对拟南芥逆境胁迫的响应[D]. 丁娜.山西农业大学 2016
[7]农杆菌介导GsZFP1基因转化亚洲百合‘Cedeazzle’的研究[D]. 张焕.东北农业大学 2014
[8]RNAi介导的抗黄瓜花叶病毒和抗百合斑驳病毒载体的构建及百合的转化研究[D]. 冯慧颖.中国农业科学院 2013
[9]番茄Sly-miR166及其靶标基因SlREV的克隆、鉴定及其对果实形成的研究[D]. 胡国建.重庆大学 2013
[10]花特异启动子调控的蓝色基因表达载体构建及功能研究[D]. 李莉.西北农林科技大学 2011
本文编号：2971650
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
左pRI101-ON载体，右pRI101-ON载体多克隆位点Fig.2-1LeftimagepRI101-ONvector,RightimagepRI101-ONvectormulti-clonebit
2lpu-miR166a初级体、LpLMBR1的克隆及生物信息学分析13挑选生长健壮的4-5周的本氏烟草，用1mL注射器吸取重悬菌液，由烟草叶片下表皮轻轻注射，直至菌液充满整个叶片，暗培养2d后光培养1d，用激光共聚焦显微镜直接观察叶片的荧光情况。2.2结果与分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由图2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR扩增片段大小在500bp左右，与预期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，测序结果表明PCR产物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息学分析测序结果表明lpu-pri-miR166a为501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查找其他物种的pre-miR166a序列。经过比对发现，lpu-pri-miR166a片段中miR166前体与芦笋的miR166的前体相似度可达98%、茶树95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase数据库（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前体序列，包括：芦笋、水稻、茶树、毛果杨、柑橘以及模式作物拟南芥、烟草和观赏性作物海棠、向日葵。将查询得到的miR166a前体与细叶百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp图2-2（左）lpu-pri-miR166a扩增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12图2-3miR166a前体序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
2lpu-miR166a初级体、LpLMBR1的克隆及生物信息学分析13挑选生长健壮的4-5周的本氏烟草，用1mL注射器吸取重悬菌液，由烟草叶片下表皮轻轻注射，直至菌液充满整个叶片，暗培养2d后光培养1d，用激光共聚焦显微镜直接观察叶片的荧光情况。2.2结果与分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由图2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR扩增片段大小在500bp左右，与预期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，测序结果表明PCR产物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息学分析测序结果表明lpu-pri-miR166a为501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查找其他物种的pre-miR166a序列。经过比对发现，lpu-pri-miR166a片段中miR166前体与芦笋的miR166的前体相似度可达98%、茶树95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase数据库（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前体序列，包括：芦笋、水稻、茶树、毛果杨、柑橘以及模式作物拟南芥、烟草和观赏性作物海棠、向日葵。将查询得到的miR166a前体与细叶百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp图2-2（左）lpu-pri-miR166a扩增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12图2-3miR166a前体序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
【参考文献】：
期刊论文
[1]龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析[J]. 张清林,苏立遥,厉雪,张舒婷,徐小萍,陈晓慧,王培育,李蓉,张梓浩,陈裕坤,赖钟雄,林玉玲. 园艺学报. 2018(08)
[2]Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制[J]. 张敏,朱明,李文宗,马洁,刘悦萍,江海洋,王磊,徐妙云. 中国农业科学. 2017(16)
[3]植物根的作用[J]. 孙映萱. 好家长. 2017(33)
[4]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[5]烟草microRNA171c的功能分析[J]. 张力,沙爱华. 植物科学学报. 2016(05)
[6]百合等球根花卉育种研究进展[J]. 肖海燕,刘青林. 中国农业科技导报. 2015(06)
[7]玉米MIR166基因家族的进化与功能研究[J]. 王艳芳,赵彦宏,刘林德,周瑞莲. 南方农业学报. 2015(08)
[8]植物体细胞胚胎发生影响因素研究进展[J]. 蔡正旺,刘静,杨松杰. 安康学院学报. 2014(04)
[9]MIR166基因家族在陆生植物中的进化模式分析（英文）[J]. 赵旭耀,陈斯云,赵磊,张雪梅,马朋飞,郭振华. 植物分类与资源学报. 2014(03)
[10]百合花特异启动子PchsA表达载体的构建及功能分析[J]. 常小丽,刘雅莉,王跃进,徐伟荣,张宗勤. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2009(02)
博士论文
[1]百合VIGS体系的建立及LhDTX35基因的克隆和功能研究[D]. 徐华.中国农业科学院 2018
[2]小麦不同生长发育时期miRNA的鉴定及2个穗/籽粒高表达miRNA功能的初步研究[D]. 简超.西北农林科技大学 2017
[3]过表达LaMIR166a在落叶松ESMs成胚发育及其萌发过程中的功能研究[D]. 李哲馨.中国林业科学研究院 2017
[4]落叶松IAA受体基因分离与干细胞极性相关miR166及其目标基因功能研究[D]. 李水根.中国林业科学研究院 2013
硕士论文
[1]细叶百合2型金属硫蛋白（LpMT2）基因的克隆及其功能解析[D]. 赵婧竞.东北林业大学 2019
[2]利用STTM技术分析拟南芥miR160和miR165/166的互作网络及玉米miR166的初步功能[D]. 杨天啸.河南农业大学 2019
[3]百合单萜合成酶基因多态性研究和功能验证[D]. 樊俊苗.山西农业大学 2018
[4]百合体胚发生过程中miR166及其靶基因的鉴定与表达分析[D]. 杨越.沈阳农业大学 2017
[5]垂花百合花青素基因 ANS 启动子的克隆及功能分析[D]. 阴婷.沈阳农业大学 2016
[6]miR165/166对番茄形态建成的调控及对拟南芥逆境胁迫的响应[D]. 丁娜.山西农业大学 2016
[7]农杆菌介导GsZFP1基因转化亚洲百合‘Cedeazzle’的研究[D]. 张焕.东北农业大学 2014
[8]RNAi介导的抗黄瓜花叶病毒和抗百合斑驳病毒载体的构建及百合的转化研究[D]. 冯慧颖.中国农业科学院 2013
[9]番茄Sly-miR166及其靶标基因SlREV的克隆、鉴定及其对果实形成的研究[D]. 胡国建.重庆大学 2013
[10]花特异启动子调控的蓝色基因表达载体构建及功能研究[D]. 李莉.西北农林科技大学 2011
本文编号：2971650
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