海南辣椒病毒病病原种类及株系多样性研究

发布时间：2017-04-25 09:19

  本文关键词：海南辣椒病毒病病原种类及株系多样性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：辣椒是海南省冬季瓜菜生产主导产业之一,是当地农民经济收入的主要来源。但是近年来,辣椒病毒病却在热带亚热带地区盛行,对辣椒造成严重质量下降和巨大产量损失。尤其是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒,该属病毒是辣椒上常见的病毒种类,对辣椒危害大,且自身变异率高,株系分化严重,常伴有混合侵染,严重危害海南辣椒产业。为明确海南辣椒病毒病的病原种类及其优势株系,本研究开展了辣椒病毒病调查研究和病毒种类、株系多样性检测分析。 首先,为全面了解侵染海南辣椒的病毒种类,我们于2013-2014年环海南岛采集辣椒病毒病疑似样品共141份,并通过RT-PCR的方法进行检测。结果显示,共检测到辣椒带毒样品99份,病毒检出率为70.2%。共检测出5种辣椒病毒,分别为辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus, ChiRSV)、甜椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus, PVMV)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)。其中,PVMV是运用Potyvirus属病毒的简并引物首次在海南辣椒上检测到的一种病毒。 其次,为深入了解辣椒病毒病的种类及其危害情况,我们对海南辣椒病毒检出情况进行了分析。以上5种病毒的检出率分别为ChiRSV38.4%、PVMV36.4%、ChiVMV14.1%、CMV40.4%口PMMoV37.4%。可见CMV的检出率最高,说明CMV仍然是海南辣椒上的优势病毒,但ChiRSV、PVMV、ChiVMV这3种Potyvirus属病毒已经发展成为海南辣椒上不可忽视的毒原,尤其是PVMV的危害不可忽视。辣椒上病毒间复合侵染严重,约一半的样品被至少2种或2种以上的病毒共同侵染,最常见的复合侵染类型以ChiRSV+PVMV和CMV+ChiRSV+PVMV形式为主。 第三,为澄清侵染辣椒的病毒的株系和亲缘关系,我们克隆了ChiRSV、PVMV和ChiVMV3种potyviruses的cp基因,进行了序列多态性分析。运用最大似然法构建系统进化树。结果表明：ChiVMV各分离物能分成4组,分别命名为Group1、 Group2、Group3和Group4, ChiVMV海南分离物之间的cp基因序列一致性大于98%,是一个株系,且属于其中的ChiVMV Group1株系；根据系统进化树,ChiRSV海南分离物的cp基因分成两个有差异的簇,各簇内的ChiRSV cp基因序列一致性高,但簇与簇的分离物之间的cp基因序列与CP氨基酸序列一致性分别为91.6%—100%,92.9%—100%,因此海南辣椒上存在两个ChiRSV株系,暂命为ChiRSV I组与ChiRSVⅡ组；PVMV海南分离物cp基因序列一致性大于98%,聚为一簇,属于一个PVMV株系,暂命为PVMV亚洲组。 第四,为明晰侵染辣椒的potyviruses的VPg基因分化,我们克隆了ChiRSV、 PVMV和ChiVMV3种potyviruses的VPg基因,进行了序列多态性分析。运用最大似然法构建系统进化树。结果表明：ChiVMV海南分离物的VPg基因序列一致性高于98%,PVMV海南分离物VPg基因序列一致性为97.9%—100%,而ChiRSV有两个组,a组与b组分离物之间的VPg基因序列与VPg氨基酸序列一致性分别为86.6%—100%,92.6%—100%。因此,海南辣椒上的ChiVMV和PVMV分离物仅各存在1组序列高度保守的VPg基因序列；ChiRSV海南分离物的VPg基因序列分成有差异的两个组。 本研究通过开展海南辣椒病毒病病原种类的鉴定,分子变异及群体结构特征等多态性分析,有利于了解辣椒病毒的发生、流行和防控,为开展抗病毒分子育种提供了科学依据。
【关键词】：辣椒病毒病 马铃薯Y病毒属 cp基因 VPg基因 序列分析 系统进化
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.418.12
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-24
• 1.1 辣椒病毒病研究进展11-18
• 1.1.1 辣椒产业概况11
• 1.1.2 侵染辣椒的主要病毒及其分布11-12
• 1.1.3 我国辣椒病毒病病原种类12-13
• 1.1.4 辣椒病毒复合侵染现象13-14
• 1.1.5 辣椒病毒的传播14
• 1.1.6 辣椒病毒病的防治方法14-15
• 1.1.7 CMV的防治研究15
• 1.1.8 potyviruses的防治研究15-17
• 1.1.9 tobamoviruses的防治研究17-18
• 1.2 Potyvirus研究进展18-22
• 1.2.1 Potyvirus常见病毒及其危害18
• 1.2.2 Potyvirus生物学特征18-19
• 1.2.3 Potyvirus基因组结构及其编码蛋白19-20
• 1.2.4 Potyvirus定种标准20
• 1.2.5 Potyvirus遗传多样性20-21
• 1.2.6 Potyvirus属病毒VPg基因研究21-22
• 1.3 本研究的目的及意义22-23
• 1.4 技术路线23-24
• 2 材料与方法24-31
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 样品材料24
• 2.1.2 主要仪器24-25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 生物信息学工具25
• 2.2 方法25-31
• 2.2.1 疑似病毒感染的141个辣椒样品叶片总RNA的提取25-26
• 2.2.2 疑似病毒感染的辣椒样品叶片总RNA的反转录实验26
• 2.2.3 反转录产物可靠性检验26-27
• 2.2.4 PCR检测病原27
• 2.2.5 PCR病原检测实验重复两次27
• 2.2.6 序列分析鉴定病原27
• 2.2.7 cp和VPg基因克隆用引物信息27
• 2.2.8 cp和VPg基因目的片段的扩增27-29
• 2.2.9 cp和VPg基因目的片段的回收纯化29-30
• 2.2.10 连接30
• 2.2.11 转化30
• 2.2.12 抗生素筛选阳性克隆30
• 2.2.13 菌液PCR鉴定重组子30
• 2.2.14 测序分析30-31
• 3 结果与分析31-59
• 3.1 海南辣椒病毒病病原鉴定结果31-38
• 3.1.1 样品RNA提取结果31
• 3.1.2 反转录结果31
• 3.1.3 海南辣椒病毒病病原种类鉴定结果31-32
• 3.1.4 海南辣椒上5种病毒病主要症状32-34
• 3.1.5 病毒间的复合感染34-36
• 3.1.6 病毒复合侵染寄主植物症状36-38
• 3.2 potyviruses cp基因的克隆与分析38-49
• 3.2.1 ChiVMV cp基因的克隆和序列分析38
• 3.2.2 ChiVMV cp基因多态性38-39
• 3.2.3 ChiVMV cp基因的系统进化树39-41
• 3.2.4 基于cp基因的ChiVMV株系划分41-42
• 3.2.5 ChiRSV cp基因的克隆和序列分析42
• 3.2.6 ChiRSV cp基因多态性42-45
• 3.2.7 ChiRSV cp基因的系统进化树45
• 3.2.8 基于cp基因的ChiRSV株系划分45-46
• 3.2.9 PVMV cp基因的克隆和序列分析46-47
• 3.2.10 PVMV cp基因的多态性47-48
• 3.2.11 PVMV cp基因的系统进化树48-49
• 3.3 potyviruses VPg基因的克隆与分析49-59
• 3.3.1 ChiVMV VPg基因的克隆与分析49-50
• 3.3.2 ChiVMV VPg基因多态性50-51
• 3.3.3 ChiVMV VPg基因的系统进化树51-52
• 3.3.4 ChiRSV VPg基因的克隆和序列分析52
• 3.3.5 ChiRSV VPg基因多态性52-53
• 3.3.6 ChiRSV VPg基因系统进化树53-55
• 3.3.7 PVMV VPg基因的克隆和序列分析55-56
• 3.3.8 PVMV VPg基因多态性56-58
• 3.3.9 PVMV VPg基因的系统进化树58-59
• 4 讨论59-62
• 4.1 辣椒病毒多样性59-60
• 4.2 病毒的复合侵染60
• 4.3 病毒基因多态性分析60-61
• 4.4 病毒株系的划分标准61-62
• 5 结论62-63
• 参考文献63-70
• 缩略语表70-72
• 附录72-73
• 致谢73

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本文编号：326070