热应激下ERK1/2信号通路对仔猪睾丸支持细胞乳酸合成的影响

发布时间：2021-07-14 13:34

　　热应激对动物健康和生殖功能均有明显的负面影响。哺乳动物在长期的进化过程中形成了防止生精细胞过度凋亡而导致雄性不育的机制。睾丸支持细胞生成的乳酸不仅能为各级生精细胞提供营养,还能增加生精细胞抗凋亡的能力;ERK1/2信号通路、HSP70在热应激后细胞的生存反应中发挥了重要作用。然而,热应激是否可以通过激活ERK1/2信号通路、增加HSP70的表达,促进睾丸支持细胞乳酸的生成目前还不清楚。因此,本试验以仔猪睾丸支持细胞为试验材料,43℃处理培养的支持细胞30 min,通过添加信号通路的抑制剂和RNA干涉技术,探索磷酸化ERK1/2在热诱导的乳酸合成中的作用,以及磷酸化ERK1/2与HSP70表达之间的关系。本试验以21日龄的仔猪睾丸为试验材料,通过43℃培养箱处理睾丸支持细胞30 min模拟热应激环境,然后在32℃培养箱恢复不同时间（0,1,2,4,6 h）。采用CCK-8试剂盒检测细胞的活率;利用定量PCR检测乳酸生成相关基因的表达,运用western blotting检测细胞中ERK1/2的磷酸化水平和乳酸分泌相关蛋白的表达,收集细胞和培养液用乳酸检测试剂盒进行乳酸分泌量的测定。根据已... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 睾丸支持细胞
        1.1.1 支持细胞的基本结构
        1.1.2 支持细胞的增殖和成熟
        1.1.3 支持细胞的功能
    1.2 睾丸支持细胞内乳酸合成及转运
        1.2.1 支持细胞内乳酸合成及转运
        1.2.2 乳酸的作用
    1.3 热应激
        1.3.1 热应激概述
        1.3.2 热应激对睾丸内细胞的影响
    1.4 ERK1/2信号通路
        1.4.1 ERK1/2信号通路概述
        1.4.2 ERK1/2信号通路的生理功能
        1.4.3 ERK1/2信号通路与热应激
    1.5 热休克蛋白 70
        1.5.1 HSP70与热应激反应
        1.5.2 HSP70与ERK1/2信号通路
        1.5.3 HSP70的其他功能
    1.6 展望
第二章 引言
第三章 试验材料与方法
    3.1 试验材料
        3.1.1 试验动物
        3.1.2 主要试验试剂和耗材
        3.1.3 主要试验仪器
        3.1.4 主要试验试剂的配制
    3.2 试验方法
        3.2.1 支持细胞的分离培养
        3.2.2 支持细胞纯度鉴定
        3.2.3 热处理
        3.2.4 U0126处理
        3.2.5 RNA干扰
        3.2.6 细胞活性检测
        3.2.7 蛋白检测
        3.2.8 mRNA检测
        3.2.9 乳酸测定
        3.2.10 LDH活性测定
    3.3 统计分析
第四章 试验结果
    4.1 支持细胞的分离培养
    4.2 RNA完整性检测
    4.3 荧光定量PCR扩增曲线和熔解曲线分析
    4.4 热应激对ERK1/2磷酸化的影响及恢复时间的筛选
        4.4.1 热应激对ERK1/2磷酸化的影响
        4.4.2 热应激后细胞恢复时间的筛选
    4.5 抑制剂U0126对热应激诱导乳酸合成量的影响
        4.5.1 U0126浓度的筛选
        4.5.2 U0126抑制作用的鉴定
        4.5.3 U0126对乳酸合成的影响
        4.5.4 U0126对LDH活性的影响
        4.5.5 U0126对ERK1/2磷酸化的影响
        4.5.6 U0126对HSP70蛋白表达的影响
        4.5.7 U0126对HSP70 mRNA水平的影响
        4.5.8 U0126对GLUT3和LDH A蛋白表达的影响
        4.5.9 U0126对SLC2A3和LDH A mRNA水平的影响
    4.6 ERK2 Si RNA对热诱导乳酸合成量的影响
        4.6.1 ERK1及ERK2 siRNA干涉片段的筛选
        4.6.2 ERK1及ERK2 siRNA干涉作用的鉴定
        4.6.3 ERK2 siRNA对乳酸合成的影响
        4.6.4 ERK2 siRNA对LDH活性的影响
        4.6.5 ERK2 siRNA对ERK1/2磷酸化的影响
        4.6.6 ERK2 siRNA对HSP70蛋白表达的影响
        4.6.7 ERK2 siRNA对HSP70 mRNA水平的影响
        4.6.8 ERK2 siRNA对GLUT3和LDH A蛋白表达的影响
        4.6.9 ERK2 siRNA对SLC2A3和LDH A mRNA水平的影响
第五章 讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
在读期间参与的课题和发表的文章


【参考文献】：
期刊论文
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[2]种公猪热应激的危害及对策[J]. 王立述,罗维平,张斌,丁秀红.  山东畜牧兽医. 2011(12)
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硕士论文
[1]HSP70对热应激条件下仔猪睾丸支持细胞乳酸合成的影响[D]. 廖婷婷.西南大学 2016
[2]猪精液冷冻保存的研究[D]. 周鑫.内蒙古大学 2012



本文编号：3284243