猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ELISA检测方法的初步建立

发布时间：2017-05-06 11:09

  本文关键词：猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ELISA检测方法的初步建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viruse,PEDV)引起的一种急性肠道疾病,以呕吐、水样腹泻为主要特征,严重时可引起病猪死亡。1978年,该病首次在英国和比利时被报道,此后欧洲、亚洲的多个国家相继报道了PED的发生与流行。近几年,一种变异的PEDV在我国猪群中开始流行,并引起七日龄以内新生仔猪严重腹泻和高死亡率,本研究从腹泻仔猪的肠道组织成功分离到一株PEDV流行毒株,测定了其全基因组序列,并初步建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法和基于单克隆抗体的竞争性ELISA方法。具体研究内容如下:1、PEDV的分离鉴定与全基因组分析本试验通过尝试多种细胞、培养系统和培养条件,成功分离出一株猪流行性腹泻病毒。通过间接免疫荧光试验(IFA)、全基因组克隆、同源性比较和系统进化树分析等证实该分离株是目前广泛流行的变异PEDV,暂时命名为SH6株,属于Group II。全序列分析证明该病毒的基因组大小为28,038 bp,从5’端至3’端,编码蛋白依次是多聚蛋白(6,781 aa),S蛋白(1,386 aa),ORF3蛋白(224 aa),E蛋白(76 aa),M蛋白(226 aa)和N蛋白(441 aa)。2、PEDV N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的初步建立为建立猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA检测方法,本研究从新分离PEDV流行毒株(JS-2013)中扩增其N基因,并将N基因克隆至p Cold-I DNA原核表达载体中,构建p Cold-I-N重组质粒,经过IPTG诱导的重组蛋白呈可溶性表达。将纯化的N蛋白作为包被抗原建立PEDV间接ELISA检测方法,并且对各种检测条件进行优化,优化后确定N蛋白最佳包被条件为37℃包被2 h,最佳抗原包被量为200 ng/孔,最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃封闭2 h,最佳血清稀释度为1:200,血清最佳孵育时间为37℃孵育20 min,二抗最适稀释度为1:2×104,二抗最佳孵育时间为40 min,临界值为0.345~0.394,介于两者之间为可疑。并对50份已知背景血清进行检测,符合率达94%。该间接ELISA方法为PEDV诊断和流行病学调查提供了依据。3、抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的初步建立将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,运用杂交瘤细胞筛选技术最终获得1株稳定分泌抗PEDV N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为:2B8。扩大培养该杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠,制备腹水。经鉴定,腹水效价在105以上。Western blot和IFA试验结果显示该单克隆抗体具有良好的反应性和特异性。与其他猪源病毒无交叉反应。将获得的单克隆抗体作为竞争一抗初步建立竞争ELISA检测方法。并对工作条件进行优化,确认最佳工作条件和阴阳性判定临界值。其中阴性血清临界值=X+2SD=33.2%,阳性血清临界值=X+3SD=38.6%,介于两者之间为可疑。本试验初步建立的两种检测PEDV抗体的ELISA方法,为PEDV变异株感染的诊断及其流行病学分析奠定了重要的基础。
【关键词】：猪流行性腹泻病毒 分离与鉴定 N蛋白 ELISA 单克隆抗体
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 附件3-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 引言13-20
• 1.1 PEDV的分类地位13
• 1.2 PEDV的形态结构及理化性质13
• 1.3 PEDV的细胞培养特性13-14
• 1.4 PEDV的基因组结构与功能14-15
• 1.5 PEDV的主要基因组结构与功能15-16
• 1.5.1 主要结构基因及其功能15
• 1.5.2 非结构基因及其功能15-16
• 1.6 PEDV的主要蛋白结构与功能16-17
• 1.6.1 结构蛋白及其功能16-17
• 1.6.2 非结构蛋白及其功能17
• 1.7 PEDV的诊断技术17-18
• 1.7.1 临床诊断及病理组织变化17
• 1.7.2 实验室诊断方法17-18
• 1.8 免疫预防18-19
• 1.8.1 PED灭活苗19
• 1.8.2 PEDV弱毒疫苗19
• 1.9 研究目的和意义19-20
• 第二章 猪流行性腹泻病毒的分离、鉴定及全基因组分析20-37
• 2.1 主要材料20-21
• 2.1.1 载体、菌株和试剂盒20
• 2.1.2 主要试剂及配制20-21
• 2.1.3 主要仪器设备21
• 2.1.4 分子生物学软件21
• 2.1.5 样品采集21
• 2.2 方法21-26
• 2.2.1 粪样的处理21
• 2.2.2 变异PEDV的分离及鉴定21
• 2.2.3 免疫荧光（IFA）检测变异PEDV21-22
• 2.2.4 病毒蚀斑纯化22
• 2.2.5 引物设计22-23
• 2.2.6 RNA的提取23-24
• 2.2.7 反转录和双链cDNA合成24
• 2.2.8 PCR扩增24-25
• 2.2.9 3’RACE和 5’RACE25
• 2.2.10 PCR产物的纯化25-26
• 2.2.11 PCR产物的测序26
• 2.2.12 变异PEDV的序列分析26
• 2.3 结果26-35
• 2.3.1 PEDV的分离及鉴定26-27
• 2.3.2 PEDV的全基因组克隆和序列分析27-35
• 2.4 讨论35-37
• 第三章 PEDV N蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立37-48
• 3.1 材料与方法37-41
• 3.1.1 主要材料与试剂37
• 3.1.2 PEDV重组N蛋白的原核表达与纯化37-39
• 3.1.3 间接ELISA检测方法的初步建立39-40
• 3.1.4 间接ELISA检测方法临界值的确立40
• 3.1.5 符合率分析40
• 3.1.6 重复性测试40-41
• 3.2 结果41-47
• 3.2.1 PEDV重组N蛋白的原核表达及纯化41-43
• 3.2.2 间接ELISA方法的建立及条件优化结果43-45
• 3.2.3 间接ELISA临界值的确立45-46
• 3.2.4 间接ELISA符合率试验结果46
• 3.2.5 间接ELISA重复性试验结果46-47
• 3.3 讨论47-48
• 第四章 抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的初步建立48-63
• 4.1 材料与方法48-54
• 4.1.1 主要材料与试剂48
• 4.1.2 包被抗原的制备48
• 4.1.3 抗N蛋白单克隆抗体的制备48-52
• 4.1.4 抗N蛋白单克隆抗体的初步应用52-53
• 4.1.5 竞争ELISA检测方法的初步建立53-54
• 4.1.6 竞争ELISA检测方法临界值的确定54
• 4.1.7 符合率分析54
• 4.1.8 重复性测试54
• 4.2 结果54-61
• 4.2.1 包被抗原的制备54
• 4.2.2 抗N蛋白单克隆抗体的制备54-56
• 4.2.3 抗N蛋白单克隆抗体的初步应用56-57
• 4.2.4 竞争ELISA检测方法的建立及条件优化结果57-60
• 4.2.5 竞争ELISA检测方法临界值的确定60
• 4.2.6 竞争ELISA检测方法符合率试验结果60
• 4.2.7 竞争ELISA检测方法重复性试验结果60-61
• 4.3 讨论61-63
• 第五章 全文结论63-64
• 参考文献64-70
• 致谢70-72
• 作者简历72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：348289