水稻OGG1基因的功能分析

发布时间：2017-06-22 08:00

  本文关键词：水稻OGG1基因的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：OGG1 (8-oxoguanine DNA glycosylase)为8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶,主要修复DNA氧化损伤,维护DNA及基因组稳定,人OGG1 (hOGG1)突变易诱发多种肿瘤。已有研究表明拟南芥OGG1 (AtOGG1)与种子成熟和萌发有关,影响种子寿命,但尚不清楚水稻OGG1 (OsOGG1)在DNA氧化损伤修复、逆境胁迫及种子寿命调控的作用模式。为剖析OsOGG1功能,我们构建了OsOGG1超表达、RNAi、亚细胞定位、原核细胞表达及启动子持久表达载体,获得了相应的转基因株系。随后,我们对转基因株系及有关材料进行分子验证与功能分析,包括启动子活性检测,烟草细胞瞬时表达,胁迫处理与基因表达及从大肠杆菌纯化GST-OsOGG1蛋白等。结果如下：(1)GUS染色分析表明,OsOGG1起始密码子前1331 bp片断能启动GUS基因表达,具有启动子活性。(2)烟草细胞共聚焦荧光观察显示OsOGG1定位于细胞核。(3)农杆菌介导法转化水稻日本晴,获得了超表达和RNAi沉默转基因T1代植株分别为38株和54株,通过对转基因植株的分子鉴定,已筛选获得6个超表达和9个RNAi沉默转基因阳性株系的T2代种子,我们将鉴定获得单拷贝的超表达和RNAi沉默转基因T2代纯系,用于后续试验分析。(4)水稻幼苗非生物胁迫(二甲基紫精30 μM Dimethyl amethyst、高温38℃、低温4℃、高盐250 mM NaCl和高渗20% PEG 6000)实验表明,二甲基紫精诱导的OsOGG1表达与超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性变化趋势一致,高盐、高温及低温处理均在3h处抑制OsOGG1表达,高渗透压处理诱导OsOGG1表达,表明OsOGG1与非生物胁迫有一定关联,其作用机理有待进一步研究。(5)水稻种子萌发试验显示在种子吸涨24 h时,日本晴、超表达和RNAi沉默株系的OsOGG1表达量最高,表明OsOGG1可能与水稻种子萌发有关。(6)原核表达OsOGG1蛋白及纯化了OsOGG1,并获得了OsOGG1多克隆抗体,为OsOGG1介导的DNA氧化损伤修复功能鉴定提供了基础。
【关键词】：水稻 OsOGG1 启动子 亚细胞定位 转基因株系 非生物胁迫 原核表达
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 前言9-15
• 1.1 植物抗逆机制研究9-10
• 1.2 非生物胁迫影响水稻生产10
• 1.3 逆境胁迫诱导ROS积累与DNA损伤10-11
• 1.4 OGG1参与碱基切除修复途径11-12
• 1.5 OGG1概述及研究现状12-13
• 1.6 OGG1介导抗逆及相关应用13-14
• 1.7 研究背景、目的和意义14-15
• 第2章 材料与方法15-32
• 2.1 实验材料、试剂及实验仪器15-20
• 2.1.1 实验材料15
• 2.1.2 试剂和药品15-16
• 2.1.3 试剂配制16-20
• 2.1.4 仪器及设备20
• 2.2 实验方法20-32
• 2.2.1 生物信息学分析应用20
• 2.2.2 OsOGG1及其启动子克隆20-21
• 2.2.3 胶回收方法21-22
• 2.2.4 质粒提取方法22
• 2.2.5 水稻DNA及RNA提取方法22-24
• 2.2.6 第一链cDNA合成24
• 2.2.7 qRT-PCR引物设计24-25
• 2.2.8 实时定量PCR反应25
• 2.2.9 烟草注射异源表达蛋白25-26
• 2.2.10 融合蛋白诱导表达、提取及纯化26-27
• 2.2.11 Western blot检测方法27-28
• 2.2.12 水稻超表达载体及基因沉默(RNAi)载体构建28-31
• 2.2.13 EHA105农杆菌感受态细胞的制备与转化31
• 2.2.14 SOD酶活性测定方法31-32
• 第3章 结果与分析32-45
• 3.1 OsOGG1基因克隆32
• 3.2 OsOGG1启动子功能表达分析32-34
• 3.2.1 OsOGG1启动子克隆及持久表达载体构建32-33
• 3.2.2 植物组织GUS染色分析启动子功能33-34
• 3.3 OsOGG1亚细胞定位分析34-36
• 3.3.1 构建OsOGG1亚细胞定位载体34-35
• 3.3.2 融合蛋白OsOGG1-GFP瞬时表达和共聚焦荧光显微观察35-36
• 3.4 转基因水稻植株鉴定与筛选36-37
• 3.5 非生物胁迫处理诱导日本晴OsOGG1的表达分析37-39
• 3.6 OsOGG1在水稻干种子及萌发过程中表达分析39-40
• 3.7 OsOGG1原核蛋白表达、纯化及抗体制备40-42
• 3.7.1 OsOGG1原核表达载体构建40-41
• 3.7.2 OsOGG1融合蛋白诱导表达分析41
• 3.7.3 OsOGG1融合蛋白纯化及Western blot检测41-42
• 3.8 讨论分析42-45
• 第4章 创新性与下一阶段工作45-46
• 4.1 创新性45
• 4.2 下一阶段工作45-46
• 参考文献46-53
• 缩略词53-54
• 致谢54-56
• 作者简历56

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 何艳冰;水稻OGG1基因的功能分析[D];湖南农业大学;2015年

2 王勇;OGG1基因在年龄相关性白内障患者晶状体中的表达及甲基化研究[D];南通大学;2014年

3 李峥;碱基切除修复基因（APE1、OGG1、XRCC1）多态性与肺癌遗传易感性研究[D];第三军医大学;2011年

  本文关键词：水稻OGG1基因的功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：471098