崂山奶山羊乳腺上皮细胞转染褪黑素合成酶基因的研究

发布时间：2017-06-22 09:06

  本文关键词：崂山奶山羊乳腺上皮细胞转染褪黑素合成酶基因的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：褪黑素(Melatonin,MT)是吲哚神经内分泌激素,具有调节生物钟、直接清除体内自由基、抗氧化和调节免疫功能等功效。通过乳腺反应器来生产褪黑素具有研究意义和商业前景。崂山奶山羊是我国特有的山羊品种,具有优良的产奶性能,是乳腺反应器的良好模型。本研究针对褪黑素关键合成酶AANAT和HIOMT基因乳腺特异性表达载体转染山羊乳腺上皮细胞的操作进行了系统的研究。本研究通过活体采集崂山奶山羊的乳腺组织,利用组织块培养法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞,纯化后分别转染AANAT和HIOMT基因,检测这两个外源基因在细胞中的表达水平和合成褪黑素的水平,以验证是否可以作为转基因的供体细胞。(1)采取绵羊松果体细胞中克隆出AANAT和HIOMT基因,使用Xho l酶切并连接,构建载体pBC1-AANAT和pBC1-HIOMTo再由质粒pcDNA3.1-myc-his中扩增纯化得到上下游均添加了Not I酶切位点的Neo片段,通过对Neo扩增片段及质粒pBC 1-AANAT/pBC 1-HIOMT进行Not I单酶切后,连接片段构建能够在真核细胞进行抗性筛选的重组质粒pBC 1-AANAT-Neo/pBC 1-HIOMT-Neo。菌液PCR和酶切验证,结果表明呈阳性,检测序列正确。(2)采集泌乳期健康崂山奶山羊乳腺组织,进行组织块贴壁培养法分离得到两组山羊乳腺上皮细胞,利用相差消化法进行乳腺上皮细胞的分离纯化。结果显示得到纯净的乳腺上皮细胞。细胞呈鹅卵石样,排列紧密,高倍显微镜下观察可见多核,呈典型上皮细胞特征。细胞生长曲线类似与“S”形,符合细胞生长的生物学规律。(3)使用脂质体2000将真核表达载体pBC1-AANAT-Neo, pBC1-HIOMT-Neo分别转染到崂山奶山羊乳腺上皮细胞中,建立了乳腺上皮细胞的两种合成酶过表达系统。通过检测转基因细胞中AANAT和HIOMT的mRNA相对表达水平,验证表达载体是否转染成功。使用添加褪黑素合成前体五羟色胺(5-HT)的诱导培养液培养转基因细胞24 h后,检测培养液中褪黑素含量。结果显示：转染AANAT和HIOMT的乳腺上皮细胞中都高表达了相应的基因,其合成酶AANAT和HIOMT的mRNA相对表达量均显著高于对照组(p0.01)；转染AANAT的乳腺上皮细胞诱导培养液中加入五羟色胺(5-HT),培养液中MT浓度显著高于对照组(p0.01)。表明此转染体系能够成功获得转AANAT及HIOMT的崂山奶山羊乳腺上皮细胞,并在存在褪黑素合成前体5-HT的情况下,合成显著高于对照组的褪黑素量(45.31±2.32 ng/mL vs. 36.14±1.82ng/mL, p0.05)。综上所述,本研究中的重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC 1-HIOMT-Neo、崂山奶山羊乳腺上皮细胞及转染体系均能用于乳腺反应器的上游实验。
【关键词】：崂山奶山羊 乳腺上皮细胞 AANAT HIOMT 褪黑素 转基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 缩略词表9-13
• 1 文献综述13-25
• 1.1 乳腺上皮细胞研究史简述13-19
• 1.1.1 乳腺上皮细胞的原代培养13-14
• 1.1.2 乳腺上皮细胞的纯化14
• 1.1.3 乳腺反应器的研究进展14-15
• 1.1.4 褪黑素及其生理功能15-18
• 1.1.5 崂山奶山羊简介18
• 1.1.6 褪黑素功能乳的发展现状与前景18-19
• 1.2 转基因动物技术的研究与应用19-25
• 1.2.1 转基因动物的研究19-22
• 1.2.2 转基因动物的应用22-23
• 1.2.3 转基因动物的安全性23
• 1.2.4 研究目的与意义23-25
• 2 材料与方法25-44
• 2.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和载体构建的材料与方法25-35
• 2.1.1 松果体及质粒来源25
• 2.1.2 主要试剂25-26
• 2.1.3 主要仪器与耗材26
• 2.1.4 实验设计26
• 2.1.5 松果体总RNA的提取26-27
• 2.1.6 RNA反转录27-28
• 2.1.7 AANAT、HIOMT基因片段扩增28-29
• 2.1.8 目的片段连接转化至pMD~(TM)19-T载体29-30
• 2.1.9 阳性克隆pMD~(TM)19-T-AANAT及pMD~(TM)19-T-HIOMT质粒提取及检测30
• 2.1.10 构建表达载体pBC1-AANAT与pBC1-HIOMT30-31
• 2.1.11 质粒pBC1-AANAT/HIOMT及质粒pcDNA3.1-myc-his的纯化31
• 2.1.12 质粒pcDNA3.1-myc-his Neo元件模板扩增及回收31-33
• 2.1.13 Neo元件模板PCR产物和载体酶切,连接33-34
• 2.1.14 连接产物转化Top 10化学感受态细胞34
• 2.1.15 重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鉴定34-35
• 2.1.16 重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鉴定35
• 2.2 崂山奶山羊乳腺上皮细胞培养的材料与方法35-39
• 2.2.1 组织来源35
• 2.2.2 主要试剂35-36
• 2.2.3 主要仪器与耗材36-37
• 2.2.4 乳腺组织的取材37
• 2.2.5 乳腺上皮细胞纯化37-38
• 2.2.6 乳腺上皮细胞传代培养38
• 2.2.7 乳腺上皮细胞的冻存和解冻培养38
• 2.2.8 乳腺上皮细胞生长曲线测定38-39
• 2.3 转褪黑素合成酶基因乳腺上皮细胞功能验证的材料与方法39-44
• 2.3.1 崂山奶山羊乳腺上皮细胞株和菌株来源39
• 2.3.2 主要试剂39
• 2.3.3 主要仪器与耗材39
• 2.3.4 重组质粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空载体pBC1和pIRES2-EGFP的纯化39-40
• 2.3.5 重组质粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空载体pBC1和pIRES2-EGFP浓度测定40
• 2.3.6 脂质体介导的外源基因转染山羊乳腺上皮细胞40
• 2.3.7 细胞总RNA的提取40-41
• 2.3.8 RNA反转录41-42
• 2.3.9 Real Time PCR42-43
• 2.3.10 数据统计分析43
• 2.3.11 细胞培养液中褪黑素浓度测定43
• 2.3.12 实验设计43-44
• 3 结果与分析44-57
• 3.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和载体构建结果44-51
• 3.1.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆结果44-45
• 3.1.2 重组质粒pBC1-AANAT与pBC1-HIOMT测序结果45-48
• 3.1.3 Neo元件模板扩增结果48
• 3.1.4 重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鉴定48-49
• 3.1.5 重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鉴定49-50
• 3.1.6 重组质粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo图谱50-51
• 3.2 崂山奶山羊乳腺上皮细胞培养的结果51-53
• 3.2.1 崂山奶山羊乳腺上皮细胞的生长特性51-53
• 3.2.2 崂山奶山羊乳腺上皮细胞生长曲线53
• 3.3 转褪黑素合成酶基因乳腺上皮细胞功能验证的结果53-57
• 3.3.1 重组质粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空载体pBC1和pIRES2-EGFP的纯化53-54
• 3.3.2 空载体pIRES2-EGFP转染崂山奶山羊乳腺上皮细胞验证54
• 3.3.3 转基因AANAT、HIOMT在崂山奶山羊乳腺上皮细胞中的表达54-56
• 3.3.4 转基因崂山奶山羊乳腺上皮细胞合成褪黑素检测56-57
• 4 讨论57-61
• 4.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆57
• 4.2 载体pBC1-AANAT-NEO和PBC1-HIOMT-NEO的乳腺特异性表达57-58
• 4.3 崂山奶山羊乳腺上皮细胞的培养58-59
• 4.4 崂山奶山羊乳腺上皮细胞转染特异性表达载体PBC1-AANAT和PBC1-HIOMT59-61
• 5 结论61-62
• 参考文献62-71
• 致谢71-72

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本文编号：471299