半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）R-spondin2基因的分子克

发布时间：2017-06-28 08:04

  本文关键词：半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）R-spondin2基因的分子克隆、表达模式及其在肌肉发育过程中功能的初步探究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：R-spondin2基因是Rspo基因家族中一员。R-spondin(Rspo)蛋白家族共有4个成员(Rspo 1-4),均为分泌性蛋白,其蛋白结构均含有以下几个典型结构域：N端含有20-25个氨基酸的信号肽区,富含半胱氨酸的弗林类似结构域FU区、I型血小板反应结构域TSP1 (thrombospondin type 1 domain)和C端富含可变数量碱性氨基酸的区域。在小鼠、爪蟾等生物体中的研究显示Rspos可以通过激活以及协同Wnt/β-catenin信号通路,从而参与对细胞增殖和分化的调控,参与影响骨骼、肌肉、血管等组织的发育以及参与四肢和雌雄性腺的分化、发育,并可能在多种疾病的发生过程中起着至关重要的作用。例如,在爪蟾的研究中发现,Rspo2通过激活经典Wnt信号通路,促进β-catenin介导的胚胎肌肉发生,而敲降Rspo2可以显著地阻抑这一过程,表明Rspo2对于依赖于Wnt的胚胎肌肉发生过程非常必要。在小鼠中,敲除对卵母细胞发生起重要作用的Nobox基因后,小鼠卵巢中Rspo2表达水平显著下降,显示Rspo2可能在Nobox下游调控卵母细胞发育,参与雌性生殖系统发育。此外,半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国北方主要的海水养殖名贵鱼类品种之一,具有很高的实用价值和经济价值。然而,半滑舌鳎体重存在雌雄个体二相性差异,对于养殖的半滑舌鳎来说,同龄的成年雌雄个体要比雄性个体大。另外,对于水产养殖鱼类来说,获得健康丰富的肌肉也是比较关注的一点。所以,基于以上情况,本研究试图着重探究R-spondin2基因在半滑舌鳎雌雄性腺分化以及肌肉发育方面潜在的功能。本实验中,通过基因克隆技术得到能够编码完整R-spondin2蛋白氨基酸的ORF序列,对预测的氨基酸序列分析可知其含有Rspo蛋白家族典型的结构,3D蛋白结构模型显示其与斑马鱼、青鲻等物种之间具有高度的蛋白保守性。实时定量PCR实验表明,在胚胎早期发育过程中,R-spondin2基因处于低水平表达,直至原肠发生；在组织中出现脑、鳃、性腺的高表达水平。性腺切片原位杂交结果显示了R-spondin2在精巢和卵巢的生殖细胞中的广泛表达,暗示其在性腺发育中的潜在作用。此外,利用斑马鱼这一模式生物作为研究平台,为研究海洋经济鱼类基因功能提供了可能。我们以显微注射技术为基础,结合斑马龟整胚染色实验以及胚胎整体原位杂交技术,初步探究得知半滑舌鳎R-spondin2基因对于早期肌肉发育具有潜在重要影响。
【关键词】：R-spondin2 半滑舌鳎 Wnt信号转导通路
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 研究背景11-23
• 1. R-spondin基因家族介绍以及研究进展11-15
• 1.1 R-spondin基因蛋白家族的结构和特点11-13
• 1.2 R-spondin基因家族蛋白各成员功能研究进展13-15
• 2. R-spondin基因家族与Wnt信号通路的联系15-20
• 2.1 Wnt信号通路简介15-18
• 2.2 R-spondin基因家族与Wnt信号通路关系的研究进展18-20
• 3. 本研究的意义以及实验设计思路20-23
• 第二章 半滑舌鳎R-spondin2基因的分子克隆、表达模式及功能的初步探究23-63
• 1. 实验材料与方法23-43
• 1.1 实验材料23-25
• 1.2 实验方法25-43
• 1.2.1 半滑舌鳎总RNA的提取、纯化及cDNA的合成25-28
• 1.2.2 半滑舌鳎R-spondin2基因片段克隆28-31
• 1.2.3 半滑舌鳎R-spondin2基因蛋白编码序列分析31
• 1.2.4 半滑舌鳎R-spondin2基因在不同组织和不同发育时序的表达分析31-32
• 1.2.5 半滑舌鳎R-spondin2基因在性腺组织中的表达分析32-39
• 1.2.6 斑马鱼胚胎显微注射39-40
• 1.2.7 注射后斑马鱼肌肉标记基因MyoD的空间表达分析40-42
• 1.2.8 注射后斑马鱼肌肉纤维整胚染色分析42-43
• 2. 实验结果及讨论43-63
• 2.1 半滑舌鳎R-spondin2基因结构分析43-49
• 2.1.1 半滑舌鳎R-spondin2基因完整ORF序列的分析结果43-46
• 2.1.2 半滑舌鳎R-spondin2基因蛋白3D模型预测及其与其他物种间比对46-47
• 2.1.3 R-spondin2基因在多物种间的染色体共线性分析47-49
• 2.1.4 讨论49
• 2.2 半滑舌鳎R-spondin2基因定量表达分析49-52
• 2.2.1 半滑舌鳎R-spondin2基因在不同组织中的表达水平分析49-50
• 2.2.2 半滑舌鳎R-spondin2基因在早期胚胎发育各时段的表达水平分析50-51
• 2.2.3 讨论51-52
• 2.3 半滑舌鳎R-spondin2基因组织表达分析52-54
• 2.3.1 半滑舌鳎R-spondin2基因在精巢组织的空间表达分析52-53
• 2.3.2 半滑舌鳎R-spondin2基因在卵巢组织的空间表达分析53-54
• 2.3.3 讨论54
• 2.4 半滑舌鳎R-spondin2基因在肌肉发育过程中功能的初步探究54-59
• 2.4.1 注射后斑马鱼肌肉标记基因MyoD空间表达分析54-57
• 2.4.2 注射后斑马鱼肌肉纤维整胚染色分析57-58
• 2.4.3 讨论58-59
• 2.5 R-spondin2抑制Wnt3A对经典Wnt信号通路的激活59-63
• 参考文献63-72
• 个人简历72-73
• 致谢73

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