葡萄VvCOR27基因的克隆与抗寒功能研究

发布时间：2017-06-29 07:00

  本文关键词：葡萄VvCOR27基因的克隆与抗寒功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：冬季低温是制约我国葡萄和葡萄酒产业发展的主要因素之一。揭示葡萄在冷胁迫下的信号转导通路、挖掘抗寒相关基因并解析其功能,对高耐寒葡萄品种的培育具有重要理论和应用价值。COR基因是最先在拟南芥中发现的响应冷胁迫的转录因子,CBF通过结合COR基因启动子中DRE/CRT结构元件诱导其表达,从而增强植株抗性。本文通过对欧亚种‘玫瑰香’葡萄(Vitis vinifera L.cv.Muscat Hamburg)转录组分析鉴定了一个响应冷胁迫的抗寒候选基因VvCOR27。通过对‘玫瑰香’葡萄VvCOR27基因进行分子克隆和结构分析,鉴定其抗寒功能。主要成果有：克隆出了VvCOR27基因,其全长序列为1202 bp,编码302个氨基酸残基,编码蛋白质大小为33 KD,发现其为稳定性较差的亲水性蛋白,具体功能有待挖掘；挖掘了12种与VvCOR27具有同源性的COR27蛋白,发现了3个特有的保守结构域,其中与梅花的PmCOR27同源性最高,暗示它们可能有相似的功能；定量RT-PCR结果表明VvCOR27的表达量在4℃处理24h后大量增加。基于基因组序列的启动子基序分析表明,VvCOR27启动子区域含有包括EE、EEL、G-box以及ABREL元件,但是其数量比AtCOR27要少,可能是其对冷胁迫的响应较AtCOR27滞后的原因。预测COR27基因参与冷调控途径,其表达量可能受脱落酸(ABA)的影响。该研究为VvCOR27转录调控机制奠定了基础。拟南芥是一种结构简单的自花受粉植物,基因高度纯合,用理化因素处理突变率很高,容易获得各种代谢功能的缺陷型,通过获得转基因拟南芥验证相关基因功能是一种操作较便可信度较高的生物工程研究方法。本文通过构建超表达载体并转化拟南芥,得到了3个超表达VvCOR27的株系。对转基因拟南芥的抗寒性检测表明,超表达VvCOR27增加了植株的抗寒能力；生理指标的测定结果显示转基因拟南芥具有更高的抗氧化酶活性和较低的膜脂过氧化程度,证实VvCOR27的过表达能明显增强植株的抗寒性；验证VvCOR27在植株响应冷胁迫途径中为正调控因子。该研究能够提高植物抗寒性的相关科研工作的进展,为植物抗逆性的研究工作提供新的思路和基础。
【关键词】：VvCOR27 ‘玫瑰香’葡萄 转基因拟南芥 抗寒性
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S663.1;Q943.2
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-12
• 第1章 绪论12-17
• 1.1 我国葡萄栽培情况概况12-13
• 1.1.1 我国葡萄栽培情况及问题12
• 1.1.2 提高葡萄抗寒性的研究进展及意义12-13
• 1.2 葡萄抗寒机制的研究概况13-15
• 1.3 本课题的研究目的和意义15-17
• 第2章 葡萄抗寒基因的挖掘和分子克隆17-32
• 2.1 实验材料17
• 2.2 实验仪器及试剂17
• 2.2.1 实验仪器17
• 2.2.2 实验试剂17
• 2.3 实验方法17-24
• 2.3.1 总RNA的提取和cDNA的生成17-19
• 2.3.2 VvCOR27基因的克隆19-20
• 2.3.3 PCR产物的回收及载体的连接20-21
• 2.3.4 DH5α感受态的制备及连接产物的转化21-22
• 2.3.5 菌液检测及测序22
• 2.3.6 生物信息学分析22-23
• 2.3.7 定量RT-PCR分析23-24
• 2.4 结果与分析24-31
• 2.4.1 总RNA的提取24
• 2.4.2 VvCOR27基因的编码区全长克隆24-25
• 2.4.3 VvCOR27基因的cDNA克隆25
• 2.4.4 VvCOR27基因的同源比对分析25-29
• 2.4.5 冷处理下VvCOR27基因的表达模式分析29-30
• 2.4.6 VvCOR27启动子调控元件分析30-31
• 2.5 讨论31-32
• 第3章 VvCOR27表达载体的构建及超表达拟南芥的鉴定32-47
• 3.1 实验材料32
• 3.1.1 菌种及载体32
• 3.1.2 试剂及仪器32
• 3.2 实验方法32-41
• 3.2.1 野生型拟南芥的培育32-33
• 3.2.2 质粒的提取33-34
• 3.2.3 表达载体的构建34-35
• 3.2.4 转化大肠杆菌及表达载体的验证35
• 3.2.5 农杆菌感受态的制备及转化35-36
• 3.2.6 农杆菌介导法转化拟南芥36-37
• 3.2.7 超表达VvCOR27拟南芥的获得及鉴定37-38
• 3.2.8 超表达VvCOR27拟南芥抗寒表型的鉴定38
• 3.2.9 超表达VvCOR27拟南芥生理指标的测定38-41
• 3.3 结果与分析41-45
• 3.3.1. 超表达VvCOR27拟南芥潮霉素抗性基因检测41-42
• 3.3.2 超表达VvCOR27拟南芥PCR检测42-43
• 3.3.3 超表达VvCOR27拟南芥抗寒性鉴定43-44
• 3.3.4 超表达VvCOR27拟南芥生理指标测定结果44-45
• 3.4 讨论45-47
• 第4章 结论与展望47-49
• 4.1 研究结论47-48
• 4.2 研究展望48-49
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位期间发表的论文55-56
• 附录56-58
• 缩略词及中英文全称58

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