七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受的作用及机制初探

发布时间：2017-09-03 07:16

  本文关键词：七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受的作用及机制初探

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【摘要】：七鳃鳗是我国东北部特有的鱼形动物,是连接无脊椎与脊椎动物的桥梁。PHB蛋白广泛分布于多种生物细胞中,主要以异源二聚体的形式锚定在线粒体内膜,动态维持线粒体结构及功能的稳定。当线粒体氧化呼吸链功能异常,氧自由基过量积累,极易形成氧化应激,它是引起神经退行性疾病、肿瘤及诸多慢性病症的重要原因。基于PHB动态调节线粒体功能稳定与细胞氧化应激反应紧密相关,PHB正逐步成为研究多种细胞增强氧化应激耐受作用的热点蛋白。然而PHB家族之一的PHB2与处于氧化应激环境中七鳃鳗适应性的关系,目前尚无人研究。本论文以七鳃鳗PHB2蛋白在组织、细胞氧化应激中的作用和机制为着眼点开展研究,有助于七鳃鳗PHB2蛋白功能的揭示,为阐述人PHB2在氧化应激中作用机制的演化提供了线索。本研究利用免疫荧光实验检测了七鳃鳗Lm-PHB2蛋白在鳃和肾细胞中的定位,利用阿霉素注射和H2O2刺激的方法分别构建七鳃鳗氧化应激动物模型和人正常细胞的氧化应激模型,通过QPCR和Western blot的方法检测了Lm-PHB2在氧化应激刺激前后各组织中的分布和表达,通过外加蛋白孵育细胞和构建真核表达载体及细胞瞬时转染实验,利用MTT法分析了重组蛋白rLm-PHB2和真核表达蛋白Lm-PHB2在人张氏肝细胞和肺上皮细胞氧化应激中的作用,利用激光共聚焦显微镜观察了氧化应激条件下Lm-PHB2在人张氏肝细胞中的定位迁移,利用QPCR法分析了氧化应激条件下Lm-PHB2与VDAC3和TP53之间的表达关系。结果表明,Lm-PHB2主要定位在线粒体和细胞核;Lm-PHB2在七鳃鳗的主要组织中均有表达,且它的表达与组织细胞的氧化应激密切相关;rLm-PHB2能够增加人张氏肝细胞和肺上皮细胞的氧化应激耐受性;Lm-PHB2增强张氏肝细胞氧化应激耐受性与其从细胞核向线粒体的定位迁移紧密相关;氧化应激条件下Lm-PHB2与VDAC3和TP53在不同组织中表现出不同的表达关系。综上,七鳃鳗Lm-PHB2能够增强细胞的氧化应激耐受性,在人张氏肝细胞中很可能是通过蛋白的定位迁移实现的,而在七鳃鳗的组织细胞中可能是利用与VDAC3和TP53的相互作用,通过多条信号通路增强细胞的氧化应激耐受性。
【关键词】：七鳃鳗 PHB2 氧化应激 耐受性增强 机制初探
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第1章 绪论9-18
• 1.1 七鳃鳗研究进展及其特殊地位9-10
• 1.1.1 东北七鳃鳗概况9
• 1.1.2 七鳃鳗研究进展9-10
• 1.1.3 七鳃鳗的研究价值10
• 1.2 PHB研究进展10-15
• 1.2.1 PHB的结构10
• 1.2.2 PHB的定位10-11
• 1.2.3 PHB的功能11-15
• 1.2.3.1 PHB在细胞核中的功能11-13
• 1.2.3.2 PHB在线粒体中的功能13-14
• 1.2.3.3 PHB在氧化应激中的作用14-15
• 1.3 氧化应激15-17
• 1.3.1 活性氧及氧化应激15
• 1.3.2 活性氧的生理功能15-16
• 1.3.3 活性氧对机体的损伤16
• 1.3.4 氧化应激的研究意义16-17
• 1.4 本论文的研究目的和意义17-18
• 第2章 phb2在七鳃鳗各组织中的表达18-31
• 2.1 实验材料与方法18-23
• 2.1.1 实验材料、试剂与设备18-19
• 2.1.2 实验方法19-23
• 2.1.2.1 免疫荧光检测Lm-PHB2蛋白的亚细胞定位19
• 2.1.2.2 阿霉素免疫东北七鳃鳗及组织分离19
• 2.1.2.3 Total RNA提取19-20
• 2.1.2.4 RNA反转录20-21
• 2.1.2.5 RT-PCR及QPCR检测phb2在各组织中的表达21-22
• 2.1.2.6 Western Blot检测PHB2在各组织中的表达22-23
• 2.2 结果23-29
• 2.2.1 七鳃鳗Lm-PHB2蛋白的亚细胞定位23-25
• 2.2.2 RNA提取结果25
• 2.2.3 氧化应激模型构建25-26
• 2.2.4 phb2在七鳃鳗各组织中mRNA的相对表达量26-28
• 2.2.5 PHB2在七鳃鳗各组织中的蛋白表达量28-29
• 2.3 讨论29-30
• 2.4 小结30-31
• 第3章 rpEGFP-N1-Lm-phb2真核表达载体的构建31-42
• 3.1 实验材料与方法31-37
• 3.1.1 实验材料、试剂与设备31-32
• 3.1.2 实验方法32-37
• 3.1.2.1 七鳃鳗phb2基因引物设计32
• 3.1.2.2 七鳃鳗phb2基因扩增32-33
• 3.1.2.3 目的片段phb2的回收33-34
• 3.1.2.4 七鳃鳗phb2基因真核表达重组质粒的构建34-35
• 3.1.2.5 质粒提取、鉴定及去内毒素35-36
• 3.1.2.6 张氏肝细胞(Chang liver cell,CHL)的培养36
• 3.1.2.7 瞬时转染36-37
• 3.2 实验结果37-40
• 3.2.1 七鳃鳗phb2基因扩增37
• 3.2.2 七鳃鳗phb2真核表达重组质粒的构建37-39
• 3.2.3 重组质粒rpEGFP-N1-Lm-phb2的真核转染验证39-40
• 3.3 讨论40-41
• 3.4 小结41-42
• 第4章 Lm-PHB2增强CHL和L132细胞的氧化应激耐受性42-51
• 4.1 实验材料与方法42-44
• 4.1.1 实验材料、试剂与设备42
• 4.1.2 实验方法42-44
• 4.1.2.1 rLm-PHB2的诱导表达42-43
• 4.1.2.2 rLm-PHB2的纯化与定量43
• 4.1.2.3 细胞培养43-44
• 4.1.2.4 MTT细胞增殖实验44
• 4.1.2.5 细胞转染44
• 4.1.2.6 Western blot实验44
• 4.2 实验结果44-49
• 4.2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化44-45
• 4.2.2 重组蛋白rLm-PHB2增强CHL和L132细胞氧化应激耐受性45-48
• 4.2.3 真核表达Lm-PHB2增强CHL细胞氧化应激耐受性48-49
• 4.3 讨论49-50
• 4.4 小结50-51
• 第5章 七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受作用的机制初探51-59
• 5.1 实验材料与方法51-53
• 5.1.1 实验材料、试剂与设备51
• 5.1.2 实验方法51-53
• 5.1.2.1 真核表达载体的瞬时转染51
• 5.1.2.2 激光共聚焦显微镜荧光检测51-52
• 5.1.2.3 QPCR检测phb2、tp53、vdac3在七鳃鳗各组织中的表达52-53
• 5.2 实验结果53-57
• 5.2.1 RNA提取结果53
• 5.2.2 氧化应激状态下Lm-PHB2蛋白的定位及迁移53-54
• 5.2.3 phb2、tp53、vdac3在免疫后七鳃鳗各组织的分布变化54-57
• 5.3 讨论57-58
• 5.4 小结58-59
• 结论59-60
• 本文创新点60-61
• 参考文献61-65
• 附录65-67
• 附录1 pEGFP-N1质粒图谱65
• 附录2 阿霉素诱导七鳃鳗氧化应激后提取心脏、肝脏、肾脏、肠、肌肉共计30个组织样品反转得到的cDNA浓度65-66
• 附录3 大肠杆菌免疫七鳃鳗后提取心脏、肝脏、肾脏共计18个组织样品反转得到的cDNA浓度66-67
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况67-68
• 致谢68

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本文编号：783594