雌激素对C型钠肽诱导的山羊卵母细胞减数分裂阻滞的影响

发布时间：2018-03-12 13:11

  本文选题：雌激素　切入点：C型钠肽　出处：《西北农林科技大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：哺乳动物卵母细胞减数分裂在胎儿时期的原始卵泡内就已经启动,随后阻滞在第一次减数分裂前期的双线期,被阻滞在双线期的初级卵母细胞的细胞核结构形成生发泡(germinal vesicle,GV),所以这一时期的卵母细胞也称为生发泡期卵母细胞。C型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)为钠尿肽家族成员之一。最近的研究发现,CNP是小鼠卵泡中天然存在的、能够维持卵母细胞减数分裂阻滞的关键物质,由壁颗粒细胞生成,而其受体NPR2(natriuretic peptide receptor 2,NPR2)由卵丘细胞产生。研究表明,卵母细胞旁分泌因子(oocyte-derived paracrine factors,ODPFs)、17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)、促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黄体素(luteinizing hormone,LH)分别通过调控CNP或NPR2的表达而参与卵母细胞减数分裂阻滞。本实验室前期研究发现,在卵母细胞体外成熟培养液中,添加不同浓度(0.27ng/mL、1.35 ng/mL、13.5ng/mL、1μg/mL和2μg/mL)的雌激素(17β-E2)对CNP介导的山羊卵母细胞减数分裂阻滞的作用表现不同,我们推测这可能是由于不同浓度雌激素通过不同的雌激素受体通路发挥调控作用。研究内容和结果如下:1.利用Hochest33342染色方法观察体外培养6 h时,统计不同雌激素浓度组GV期卵母细胞百分率,分析不同浓度雌激素对CNP诱导的山羊卵母细胞细胞减数分裂阻滞的影响。结果表明,低浓度雌激素促进了CNP对山羊卵母细胞减数分裂阻滞的维持作用;而高浓度雌激素则降低了CNP对山羊卵母细胞减数分裂阻滞的维持作用,促进了卵母细胞的核成熟。2.在上述试验基础上,利用不同雌激素受体的抑制剂或激活剂来探讨高浓度或低浓度雌激素通过何种受体通路介导CNP诱导的山羊卵母细胞减数分裂阻滞。高浓度雌激素(1μg/mL17β-E2)试验结果表明,雌激素膜受体抑制剂G15的添加使培养后GV期卵母细胞比率显著升高,与单独添加CNP组无显著差异(P0.05);而雌激素核受体抑制剂ICI182780的添加并没有影响高浓度雌激素的作用;膜受体激活剂G1的添加,证明了高浓度雌激素通过膜受体GPR30降低了CNP对卵母细胞减数分裂阻滞的维持作用。低浓度雌激素(0.27 ng/mL17β-E2)试验结果表明,G15的添加并没有阻断低浓度雌激素对CNP诱导的山羊卵母细胞减数分裂阻滞维持作用的升高,而ICI182780却阻断了雌激素的这种作用。证明,低浓度雌激素通过核受体ERα、ERβ促进CNP对山羊卵母细胞减数分裂阻滞的维持作用。3.高浓度或低浓度雌激素对CNP介导的卵母细胞减数分裂阻滞的作用有可能是通过调控Npr2 mRNA的表达而发挥作用的。COCs体外培养2 h时,高浓度雌激素降低了COCs中Npr2 mRNA的表达水平,而低浓度雌激素升高了Npr2 mRNA的表达水平;培养4 h和6 h时,与同时间段仅添加CNP的对照组相比,高浓度或低浓度雌激素都升高了Npr2 mRNA的表达水平。但是无论是高浓度还是低浓度雌激素的添加,随着培养时间的延长,对Npr2 mRNA表达的上调作用都是减弱的;培养4 h和6 h时,由于低浓度雌激素的添加,能够维持Npr2 mRNA表达在一个较高水平,而且与培养2 h时CNP组无显著差异(P0.05),说明低浓度雌激素可以在一定时间内维持体外培养的COCs中Npr2mRNA的表达。4.利用不同的雌激素受体抑制剂或激活剂,进一步探讨COCs培养2 h时高浓度雌激素对Npr2 mRNA表达的调控。结果表明,G15阻碍了高浓度雌激素对Npr2 mRNA的下调作用,而ICI182780并不表现此作用;G1的添加起到了与高浓度雌激素添加类似的、下调Npr2 mRNA表达的作用,进一步证明高浓度雌激素通过GPR30下调Npr2m RNA表达。5.将山羊COCs分别在添加CNP、CNP+E2(0.27 ng/mL)和CNP+E2(1μg/mL)的体外成熟培养液中培养6 h,后转入常规成熟培养液培养18 h,统计卵丘细胞扩展和卵母细胞成熟情况。结果表明,CNP组和CNP+E2(0.27 ng/mL)组卵母细胞成熟率分别为70.00±5.93%和73.73±6.28%(P0.05);CNP+E2(1μg/mL)组为52.83±8.11%,显著低于CNP组和CNP+E2(0.27 ng/mL)组(P0.05)。两步法体外成熟培养山羊COCs后,卵丘细胞出现了不同程度的扩展,三个培养组卵丘细胞0级、Ⅰ级和Ⅲ级扩展的COCs比例差异不显著(P0.05);CNP和CNP+E2(0.27 ng/mL)组卵丘细胞Ⅱ级扩展的数目显著高于CNP+E2(1μg/mL)组(P0.05),而Ⅳ级扩展比例则为CNP+E2(1μg/mL)组显著高于CNP组和CNP+E2(0.27 ng/mL)组(P0.05)。综上所述,卵母细胞体外成熟培养液中雌激素浓度对CNP诱导的山羊卵母细胞减数分裂阻滞的作用不同。高浓度雌激素通过膜受体GPR30降低了CNP对山羊卵母细胞减数分裂阻滞的维持作用;而低浓度雌激素通过核受体ERα、ERβ促进了CNP对山羊卵母细胞减数分裂阻滞的维持作用。高浓度雌激素对CNP介导的山羊卵母细胞减数分裂阻滞作用的减弱,是通过膜受体GPR30通路下调Npr2 mRNA表达来发挥作用的;而低浓度雌激素对CNP介导的山羊卵母细胞减数分裂阻滞作用的促进,是通过上调Npr2mRNA的表达来发挥作用的。两步法体外培养山羊COCs成熟后,高浓度雌激素显著促进了卵丘细胞的扩散,但是却降低了卵母细胞成熟率。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827

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本文编号：1601701