鞭毛蛋白增强狂犬病疫苗免疫效果的研究

发布时间：2019-09-05 12:25

【摘要】：狂犬病又称恐水病,是由狂犬病病毒引起的、迄今为止人类唯一病死率几乎高达100%的人畜共患中枢神经系统传染病,严重威胁人们的生命安全。目前为止,狂犬病尚无有效的治疗方法。狂犬病疫苗的紧急预防接种是预防狂犬病病毒感染的最有效方法之一。目前,我国动物使用的狂犬病疫苗主要是弱毒活疫苗。但由于弱毒苗存在毒力回复、突变等潜在的安全隐患问题,WHO曾表明家养动物不适合用弱毒苗免疫。所以,要防治狂犬病的发生重要的是研制出更安全有效的疫苗。腺病毒活载体疫苗因其自身的优越性和应用的广泛性,已被应用于狂犬病基因工程疫苗的研究。鞭毛蛋白是鞭毛的主要组成成分。它不仅在细菌运动方面起着重要作用,而且也可以与表达于上皮细胞、单核细胞和未成熟的树突状细胞的顶端和基底外侧的TLR5受体结合,从而诱导分泌前炎性因子和细胞因子,介导激活T细胞和B细胞应答。因此,鞭毛蛋白可以作为疫苗佐剂,增强疫苗的免疫效果,具有良好的应用前景。本试验成功表达并纯化了鞭毛蛋白FljB、FliC和FljB’-FliC。纯化的蛋白与狂犬病毒灭活疫苗(whole-killed rabies vaccine,WKRV)一起免疫小鼠。小鼠共五组:((1)PBS;(2)WKRV;(3)WKRV和10μg FljB;(4)WKRV和10μg FliC;(5)WKRV和10μg FliB’-FliC。每组10只小鼠,每隔两周进行一次免疫,共免疫两次。在免疫后0天、7天、14天、21天、28天和35天采血,通过ELISA的方法检测抗体水平。用ELISPOT的方法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的变化。抗体结果表明:FljB有望成为WKRV的佐剂;免疫了FliC后能够提高免疫反应,但效果不明显;FljB’-FliC不能提高WKRV的体液免疫反应。细胞因子检测结果表明:FljB诱导产生的Th1和Th2免疫反应要强于FliC;FliB’-FliC不能增强细胞免疫反应。本试验采用腺病毒表达系统,构建了表达狂犬病毒G蛋白、G蛋白与鞭毛蛋白FljB和G蛋白与FliC的复制缺陷型重组腺病毒Ad-G、Ad-GB和Ad-GC。用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,每隔两周免疫一次,共免疫三次。在免疫后0天、14天、28天、35天和42天采血,通过间接ELISA的方法检测狂犬病毒G蛋白的抗体IgG水平。通过ELISPOT的方法检测细胞因子IL-4和IFN-γ的变化。用FCM进行了CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的检测。抗体检测结果表明:FljB和FliC均有增强体液免疫的作用,并且FljB比FliC的效果好。细胞因子检测结果表明:FljB和FliC均有增强细胞免疫的作用,并且FljB比FliC的效果好。FCM检测结果表明:FljB和FliC均能够增强诱导Th和Tc细胞的增殖。综上所述,鞭毛蛋白FljB和FliC无论是在狂犬病毒灭活疫苗中还是在腺病毒共表达G蛋白和鞭毛蛋白的基因工程疫苗中,均有免疫增强作用。并且,FljB总体上来说比FliC的增强效果更显著。表明了FljB有望成为狂犬病疫苗的佐剂,从而为研制安全、高效的狂犬病疫苗提供一定的参考作用。
【图文】：

形态图,狂犬病毒,形态

现症状的人可以通过实验室诊断来检测是否患狂犬病，比如，用直接荧光抗体检测肤活检样本中的 RABV，用 RT-PCR 检测唾液，用抗体检测血清或脑脊液。对动物乐死动物的脑组织样本可以通过直接荧光抗体检测的方法来检测 RABV。除了在公工作的人，大多数人很难有机会进行狂犬病检测。然而，作为预防兽医工作者，应的诊断实验是有用的以及在诊断病毒时需要什么样的样本。记住一些关于狂犬病的的治疗以及保护身边人的安全都是很有帮助的。狂犬病病毒研究病毒粒子的结构特点犬病病毒（rabies virus, RABV）是单股负链不分节段的 RNA 病毒，含有囊膜，属(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)，具有嗜神经性( Mayo et al., 2006; Ros)。电镜下观察，RABV 成熟的病毒粒子直径约 75 nm，不同的毒株病毒粒子长度有约 170~180 nm，一端平凹，另一端钝圆，形状呈典型的子弹状结构 ( King et al., 1-2 所示。病毒粒子由脂质双层外膜、基因组 RNA 和核蛋白、衣壳基质蛋白、转录以及包膜基质蛋白 5 种结构蛋白组成。

示意图,基因组结构,示意图,糖蛋白

中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的排列顺序为 3'-N-P-M-G-L-5'。基因组中约 91%的核苷酸编码结构蛋白，由 3′ 端 poly(A)～5′端 AACA 分别编码病毒核蛋白（Nucleoprotein）、磷蛋白（phosphoprotein）、膜基质蛋白（matrixprotein）、糖蛋白（glycoprotein）和依赖 RNA 的 RNA 多聚酶(RNA polymerase, L)( Tordo et al.,1998 )，基因长度分别为 1424 bp，991 bp，804/805 bp，1675 bp、6475/6476 bp，对应的 ORF 大小依次为 1353 bp，894 bp，609 bp，1575 bp，6429 bp ( 韦平等, 2008 )。RABV 编码的五个结构蛋白中糖蛋白(G)是存在病毒颗粒表面的唯一的蛋白质，以三聚体形式存在，，可与细胞受体结合，是 RABV 的主要保护性抗原，能诱导机体体液免疫的产生和刺激 T 细胞作用产生细胞免疫。当前无论是人用狂犬病疫苗还是兽用疫苗的效价主要取决于疫苗制剂中糖蛋白的含量。RABV 和其他弹状病毒的辨别有赖于非编码区的差异( Wunner et al., 1988 )。病毒在感染宿主细胞后会在 3′端非编码区产生一个由 58 个核苷酸组成的先导序列，该序列在复制过程中不翻译；编码核蛋白、磷蛋白、膜基质蛋白、糖蛋白和依赖 RNA 的 RNA 多聚酶的各结构基因之间含有不同长度的不转译间隔区，间隔区大小分别为 2、5、5、423 nt( Wunner et al., 1988 )；在基因组的 5′端非编码区是一个 70 个核苷酸组成的非转录序列（见图 1-3）。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

【参考文献】