栀子苷抗LPS诱导的乳腺炎性损伤的分子机制

发布时间：2020-02-14 08:22

【摘要】：乳腺炎通常是由微生物感染乳腺所引发的炎性反应，是造成奶牛业损失的重大疾病。乳腺炎造成的损失中70%为产奶量下降，常归咎于乳腺组织损伤所引起的上皮细胞数量和活性的降低。栀子苷以其抗炎、抗氧化等药理作用被广泛应用，本研究利用原代奶牛乳腺上皮细胞、小鼠乳腺上皮细胞及小鼠乳腺炎动物模型，研究了栀子苷对LPS诱导的乳腺炎性损伤的保护作用，以期为栀子苷应用于临床治疗奶牛乳腺炎提供理论依据。首先，利用组织块法和差速消化法，分离纯化原代奶牛乳腺上皮细胞，，栀子苷预处理后给予LPS刺激，MTT法检测栀子苷对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用，qRT-PCR检测栀子苷对奶牛乳腺上皮细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平的影响，LIVE/DEAD检测栀子苷对奶牛乳腺上皮细胞存活情况的影响。结果显示，栀子苷在0-200μg/ml浓度时对奶牛乳腺上皮细胞没有毒性作用；栀子苷能够显著降低由LPS刺激引发的奶牛乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表达的升高；明显减少LPS诱导的细胞死亡。其次，利用混合酶消化法，分离纯化原代小鼠乳腺上皮细胞，栀子苷预处理后给予LPS刺激，MTT法检测栀子苷对小鼠乳腺上皮细胞的毒性作用，ELISA检测栀子苷对乳腺上皮细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响，LIVE/DEAD检测栀子苷对小鼠乳腺上皮细胞存活情况的影响，Western Blot检测栀子苷对NF-κB、MAPKs信号通路及Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53和TLR4蛋白表达的影响。qRT-PCR检测栀子苷对TNF-α、IL-1β、IL-6等蛋白的mRNA水平的影响，结果显示，栀子苷在0-100μg/ml浓度时对小鼠乳腺上皮细胞没有毒性作用；栀子苷能够显著降低由LPS刺激引发的小鼠乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表达升高；明显减少LPS诱导的细胞死亡，减少TLR4的表达，抑制NF-κB、MAPKs信号通路的激活，显著下调Bax的表达，促进Bcl-2的表达，抑制Caspase-3的裂解和p53的磷酸化。最后，为进一步验证栀子苷抗LPS诱导的乳腺炎性损伤效果，实验利用乳导管灌注LPS建立小鼠乳腺炎模型，通过ELISA检测栀子苷对乳腺组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响，H.E.染色检测栀子苷对乳腺组织病理组织学变化的影响，TUNEL检测栀子苷对LPS诱导的乳腺组织凋亡的影响。结果显示，栀子苷能够显著减少乳腺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，保护乳腺结构的正常及完整性，减轻LPS诱导的小鼠乳腺组织的凋亡。综上所述，本研究表明栀子苷通过减少TLR4的表达，抑制NF-κB、MAPKs信号通路的激活，显著下调Bax的表达，促进Bcl-2的表达，抑制Caspase-3的裂解活化和p53的磷酸化，从而发挥对LPS诱导的炎性损伤保护作用，且具有良好的效果。表明栀子苷是一个潜在治疗大肠杆菌性奶牛乳腺炎的药物，也许未来会应用于奶牛乳腺炎的治疗。
【图文】：

栀子苷,分子结构式

图 2-1 栀子苷的分子结构式Fig.2-1 The molecular structure of genipos作用鸡卵清蛋白（Ova）诱导 BALB/c 小鼠建20、40、80 mg/kg）治疗，结果表明IL-5、IL-13）及血清 IgE 水平，减轻嗜高反应性、黏液分泌过多及特异性 IgE其机制与阻断 NF-κB 信号转导通路的鼻腔滴注 LPS 建立肺损伤模型，给予可降低小鼠肺干湿比（W/D 值）；改细胞浸润；抑制炎性细胞因子 TNF-α

腺上皮细胞

4.吸取每孔细胞培养基，加入 2ml 染色混合液，37℃孵育 15min 后，于免荧光显微镜下观察细胞存活情况。1.2.6 数据分析利用 GraphPad Prism5 软件对实验所获得的所有数据结果进行 one-wANOVA 或 Student’s t-test 分析。P<0.05 即具有显著性差异。1.3 结果1.3.1 原代奶牛乳腺上皮细胞鉴定采用组织块培养法及差速消化法获得纯化的原代奶牛乳腺上皮细胞，利用乳动物上皮细胞阳性表达角蛋白-18 这一特性，对分离的奶牛乳腺上皮细胞进免疫荧光鉴定。结果如图 1-1 所示，细胞胞浆被染成绿色，细胞核被染成蓝色表明分离的细胞为奶牛乳腺上皮细胞。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S853.7

【参考文献】