叶酸和蛋氨酸调控肉鸡PBMC促炎性细胞因子转录表观遗传机制

发布时间：2017-03-26 23:05

  本文关键词：叶酸和蛋氨酸调控肉鸡PBMC促炎性细胞因子转录表观遗传机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：炎症刺激引发的机体免疫反应,会导致营养素向免疫系统分配,从而影响肉鸡的能量和蛋白质代谢,降低肉鸡采食量和生产性能。促炎性细胞因子的释放在营养素分配、炎症发生过程中起关键作用,表观遗传学修饰可调控特异基因(促炎性细胞因子)的表达。本研究分3个试验,从利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建肉鸡外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)体外炎症模型入手,分析促炎性细胞因子转录的表观遗传学修饰,研究叶酸(folic acid,FA)和蛋氨酸(methionine,Met)对LPS刺激的促炎性细胞因子转录的表观遗传学调控,以期为营养表观遗传调控肉鸡炎症反应提供理论依据。试验一LPS刺激对肉鸡PBMC促炎性细胞因子表达的影响本试验通过研究LPS不同刺激时长(0,3,6 h)和刺激浓度(0,5,10,15,20 mg/L)对肉鸡PBMC促炎性细胞因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)表达的影响,建立肉鸡PBMC体外炎症模型。结果显示LPS刺激时长和剂量对三种促炎性细胞因子的表达均存在交互作用(P0.001);LPS刺激时长为3 h时,能显著提高三种促炎性细胞因子的表达量(P0.001);不同浓度的LPS均能显著提高三种促炎性细胞因子的mRNA表达量(P0.001),LPS为低浓度5 mg/L时,IL-1β的表达量显著高于其他组;LPS为较高浓度15 mg/L和20 mg/L时,IL-6的表达量显著高于其他组。在LPS刺激时长为3 h时,IL-1β表达量在刺激浓度为5 mg/L时最高;IL-6表达量在刺激浓度为20 mg/L时最高;TNF-α表达量在刺激浓度为10 mg/L时最高。因此,LPS刺激建立肉鸡PBMC体外炎症模型成功,选择LPS刺激时长为3 h,刺激浓度为10 mg/L。试验二LPS刺激对肉鸡PBMC促炎性细胞因子表观遗传学修饰的影响本试验采用BSP法和Dnase I-qPCR法检测LPS刺激后肉鸡PBMC促炎性细胞因子基因启动子区的DNA甲基化和染色质构象变化,并用DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,AZA)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂古曲抑菌素(trichostatin A,TSA)研究促炎性细胞因子表达与DNA甲基化和染色质结构的关系。结果显示,LPS处理组显著降低DNMT1(P0.05)和HDAC2(P0.05)的表达量,但显著提高了PCAF和Tip60的表达量(P0.05)。LPS处理显著降低了IL-6启动子区-264和-302 CpG位点的甲基化水平(P0.05),且显著降低了TNF-α启动子区的总体甲基化(P0.05)和-371 CpG位点的甲基化水平(P0.05),但对IL-1β启动子区甲基化水平无显著影响。LPS处理显著降低IL-1β和IL-6启动子区染色质构象的紧密度(P0.05),但对TNF-α启动子区染色质构象的紧密度无显著影响。LPS处理显著降低DNMT1,DNMT3a和DNMT3b的表达量(P0.05);但AZA处理对DNMTs表达无显著影响。LPS显著提高IL-1β,IL-6和TNF-α的表达量(P0.05),且AZA/LPS处理组的IL-6和TNF-α表达显著高于LPS处理组(P0.05)。TSA处理显著降低了HDAC2,HDAC3,HDAC8和HDAC9的表达量(P0.05);LPS刺激显著降低了HDAC2,HDAC3,HDAC7,HDAC8,HDAC9和HDAC10的表达量(P0.05);TSA/LPS处理显著降低了HDAC2,HDAC3,HDAC8,HDAC9和HDAC10的表达量(P0.05)。LPS处理显著提高了三种促炎性细胞因子的表达(P0.05);TSA/LPS的处理能显著降低由LPS刺激引起的三种促炎性细胞因子的高表达(P0.05)。结果表明,LPS引起的IL-1β高表达与染色质构象有关,IL-6高表达与DNA甲基化和染色质构象有关,TNF-α高表达与DNA甲基化有关,HDACi可作为可能的抗炎制剂。试验三叶酸和蛋氨酸对LPS刺激的肉鸡PBMC促炎性细胞因子转录的表观遗传调控本试验通过分析肉鸡PBMC增殖活性、DNA甲基转移酶表达、促炎性细胞因子表达及其启动子区DNA甲基化变化,研究叶酸和蛋氨酸对LPS刺激的肉鸡PBMC促炎性细胞因子转录的表观遗传学调控。结果显示,Met和FA对肉鸡PBMC增殖活性存在交互作用(P0.001),Low-Met和Low-FA显著抑制了肉鸡PBMC的转化率(P0.001),High-Met和High-FA显著促进了肉鸡PBMC的增殖(P0.001)。Met和FA对肉鸡PBMC DNMTs的表达存在交互作用;与Medium-Met相比,Low-Met显著提高了DNMT1和DNMT3a的表达量,High-Met显著降低了DNMT3a的表达量;与Medium-FA相比,Low-FA显著提高了DNMT1,DNMT3a的表达量,且High-FA显著提高了DNMT1的表达量。与Low-Met相比,High-Met显著降低了IL-6的表达量(P0.05);Medium-Met显著降低了TNF-α的表达量(P0.05);FA对促炎性细胞因子表达无显著影响。High-Met组极显著提高IL-6-191 CpG位点甲基化水平(P0.001)。Medium-Met组显著提高TNF-α-419 CpG位点甲基化水平(P0.05)。结果表明,Met可通过影响IL-6和TNF-α基因特异位点的甲基化水平,进而影响其转录水平,缓解炎症反应。本研究表明,LPS刺激引起的肉鸡PBMC促炎性细胞因子高表达与其启动子区的表观遗传学修饰改变相关;Met可通过提高促炎性细胞因子启动子区的甲基化水平,降低其转录水平,缓解炎症反应;FA对促炎性细胞因子表达无影响。
【关键词】：肉鸡PBMC 促炎性细胞因子 DNA甲基化 蛋氨酸 叶酸
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文献综述13-22
• 1.1 炎症13-15
• 1.1.1 炎症反应13-14
• 1.1.2 炎症模型建立14
• 1.1.3 炎症反应机制14-15
• 1.2 营养表观遗传学15-17
• 1.2.1 表观遗传学15-16
• 1.2.2 营养表观遗传学16-17
• 1.3 炎症的营养表观遗传学调控17-20
• 1.3.1 DNA甲基化17-18
• 1.3.2 组蛋白修饰18-20
• 1.4 研究问题的提出及研究内容20-22
• 1.4.1 研究问题的提出20-21
• 1.4.2 研究内容21
• 1.4.3 技术路线21-22
• 第二章 LPS刺激对肉鸡PBMC促炎性细胞因子表达的影响22-27
• 2.1 材料与方法22-25
• 2.1.1 试验设计22
• 2.1.2 试验材料与仪器22-23
• 2.1.3 细胞分离培养23
• 2.1.4 RT-qPCR法检测相应基因mRNA相对表达量23-24
• 2.1.5 数据分析24-25
• 2.2 结果25-26
• 2.2.1 LPS刺激对肉鸡PBMC促炎性细胞因子表达的影响25-26
• 2.3 讨论26
• 2.4 小结26-27
• 第三章 LPS刺激对肉鸡PBMC促炎性细胞因子表观遗传学修饰的影响27-40
• 3.1 材料与方法27-32
• 3.1.1 试验设计27-28
• 3.1.2 试验材料与仪器28
• 3.1.3 BSP方法检测基因启动子区DNA甲基化水平28-30
• 3.1.4 Dnase I-qPCR方法检测基因启动子区染色质构象30-31
• 3.1.5 RT-qPCR方法检测相应基因mRNA相对表达量31-32
• 3.1.6 数据分析32
• 3.2 结果32-38
• 3.2.1 LPS刺激对肉鸡PBMC促炎性细胞因子DNA甲基化的影响32-34
• 3.2.2 LPS刺激对肉鸡PBMC促炎性细胞因子染色质构象的影响34
• 3.2.3 LPS刺激对肉鸡PBMC表观遗传学相关酶表达的影响34
• 3.2.4 促炎性细胞因子启动子区转录因子结合位点的预测34-35
• 3.2.5 AZA对肉鸡PBMC促炎性细胞因子及DNA甲基转移酶表达的影响35-36
• 3.2.6 TSA对肉鸡PBMC组蛋白去乙酰化酶及促炎性细胞因子表达的影响36-38
• 3.3 讨论38-39
• 3.4 小结39-40
• 第四章 叶酸和蛋氨酸对LPS刺激的肉鸡PBMC促炎性细胞因子转录的表观遗传学调控40-46
• 4.1 材料与方法40-41
• 4.1.1 试验设计40
• 4.1.2 试验材料与仪器40
• 4.1.3 MTT法检测细胞增殖活性40-41
• 4.1.4 RT-qPCR方法检测相应基因mRNA相对表达量41
• 4.1.5 BSP方法检测基因启动子区DNA甲基化水平41
• 4.1.6 统计方法41
• 4.2 结果41-44
• 4.2.1 叶酸和蛋氨酸对LPS刺激的肉鸡PBMC增殖活性的影响41-42
• 4.2.2 叶酸和蛋氨酸对LPS刺激的肉鸡PBMC DNA甲基转移酶表达的影响42-43
• 4.2.3 叶酸和蛋氨酸对LPS刺激的肉鸡PBMC促炎性细胞因子表达的影响43
• 4.2.4 叶酸和蛋氨酸对LPS刺激的肉鸡PBMC促炎性细胞因子DNA甲基化的影响43-44
• 4.3 讨论44-45
• 4.4 小结45-46
• 第五章 总体结论与建议46-47
• 5.1 本研究的主要结论46
• 5.2 有待进一步研究的问题46-47
• 参考文献47-53
• 致谢53-54
• 作者简介54-55

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