新疆尉犁县哨兵动物感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定

发布时间：2017-03-30 02:03

  本文关键词：新疆尉犁县哨兵动物感染蓝舌病及其病原的分离与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的非接触性的经媒介昆虫库蠓(Culicoides)传播感染绵羊、山羊和牛等多种家养和野生反刍动物的疾病。该病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属,目前已有27个血清型。该病的感染与传播受到库蠓活动的影响。BT以发热、口腔黏膜及舌头充血、糜烂,严重时舌头发绀为特征性临床症状,并能引起妊娠母畜流产、死胎等,对养殖业造成重大损失。本实验根据新疆蓝舌病流行病学调查的历史资料及近几年的BTV血清学调查结果和媒介昆虫库蠓的生活习性,选择新疆尉犁县作为监控点,并放置哨兵动物绵羊5只、山羊5只和牛10头。从2014年5月25日,每周定期采取血样,共采样21次,采集血清和肝素钠抗凝血各420份。采用BTV竞争性ELISA方法检测哨兵动物血清,对BT感染情况进行血清学检测;采集蓝舌病抗体由阴转阳的哨兵动物血液样品接种BHK-21进行BTV病毒分离;对分离时出现细胞病变(CPE)的样品,采用BTV抗原捕获ELISA、BTV群特异性片段VP7的RT-PCR扩增及透射电镜形态学观察,对CPE样品进行BTV血清群的鉴定。再采用BTV型特异性片段VP2的RT-PCR扩增、1~24型的血清及病毒中和实验,鉴定BTV分离毒株的血清型。结果显示:BTV竞争性ELISA方法共检出8只哨兵动物血清转阳,其中绵羊转阳率15%(3/20),转阳时间为6月~7月;山羊转阳率25%(5/20),转阳时间为9月~10月,牛未发生转阳。根据转阳时间可看出绵羊的易感早于山羊。转阳哨兵动物抗凝血接种BHK-21细胞,有7份血样出现CPE,主要表现为细胞皱缩、变圆、团聚现象,随后开始脱落,间隙加大,形成空斑。分离株经BTV抗原捕获ELISA检测均为阳性;阳性分离毒株电镜下观察呈现典型BTV形态特征:中心的病毒颗粒与核衣壳分界明显,并被病毒表面的绒毛层包围,大小约70~80 nm;分离毒株TCID50在10-3.33/0.1 m L~10-5/0.1 m L之间;BTV群特异性片段VP7基因扩增、测序比对、遗传进化分析与BTV序列的同源性最高为80%~82%。经以上鉴定7株分离毒株均为蓝舌病病毒。病毒中和试验结果表明本次分离毒株及相应血清与现有BTV 1~24型均无中和保护能力,每孔均发生CPE;型特异性片段VP2测序结果NCBI比对显示与现有的BTV血清型毒株同源性从64%到70%不等,与其他病毒无同源性。由此可得7株分离毒株属于BTV血清群,但不属于现有的BTV血清型。结果表明:本试验首次从新疆分离到了非BTV 1~24型的BTV新毒株,暂定名为XJ/1/2014~XJ/7/2014。初步判定其为BTV的变异株,具体血清型鉴定尚需进一步研究确定。
【关键词】：蓝舌病 病毒 分离 鉴定
【学位授予单位】：新疆农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 英文缩略词表9-10
• 第1章 绪论10-26
• 1.1 蓝舌病流行情况概述10-14
• 1.1.1 国外流行情况10-11
• 1.1.2 国内流行情况11-12
• 1.1.3 BTV的传播12-14
• 1.2 病原学14
• 1.3 病毒的结构14-17
• 1.3.1 病毒结构蛋白15-17
• 1.3.2 非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A和NS417
• 1.4 BTV的致病机理与临床症状17-20
• 1.4.1 BTV致病机理17-19
• 1.4.2 临床症状19-20
• 1.5 BTV的检测方法20-22
• 1.5.1 琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）20
• 1.5.2 竞争性ELISA20-21
• 1.5.3 抗原捕获ELISA21
• 1.5.4 微量血清中和实验21
• 1.5.5 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）21-22
• 1.6 疫苗的研究22-25
• 1.6.1 弱毒疫苗22-23
• 1.6.2 灭活疫苗23
• 1.6.3 病毒样颗粒（VLPs）23-24
• 1.6.4 重组疫苗24
• 1.6.5 反向遗传改造蓝舌病疫苗24-25
• 1.7 防控措施25
• 1.8 小结25-26
• 第2章 新疆尉犁县监哨兵动物血清学检测26-31
• 2.1 监控群的建立26
• 2.2 血清学检测26-28
• 2.2.1 实验材料26-27
• 2.2.2 检测血清的准备27
• 2.2.3 实验方法27-28
• 2.3 结果28-29
• 2.4 讨论29-31
• 第3章 新疆尉犁县哨兵动物BT病毒的分离31-37
• 3.1 实验材料31-32
• 3.1.1 细胞31
• 3.1.2 实验试剂31
• 3.1.3 主要的仪器及耗材31-32
• 3.2 实验方法32-34
• 3.2.1 接种样品的准备32
• 3.2.2 BHK-21细胞培养32-34
• 3.2.3 细胞接毒34
• 3.2.4 分离物的保存34
• 3.3 结果34-36
• 3.4 讨论36-37
• 第4章 新疆尉犁县哨兵动物BT分离毒株的鉴定37-61
• 4.1 实验材料37-38
• 4.1.1 主要试剂37
• 4.1.2 仪器及耗材37-38
• 4.2 实验方法38-48
• 4.2.1 BTV抗原捕获ELISA检测38-39
• 4.2.2 BTV VP7片段RT-PCR扩增39-41
• 4.2.3 BTV VP2片段RT-PCR扩增41-44
• 4.2.4 病毒形态学观察44
• 4.2.5 病毒TCID50测定44-45
• 4.2.6 血清中和实验45-47
• 4.2.7 病毒中和实验47-48
• 4.3 结果48-59
• 4.3.1 BTV抗原捕获ELISA实验结果48-49
• 4.3.2 Total RNA提取结果49
• 4.3.3 BTV VP7片段扩增结果49-51
• 4.3.4 BTV VP2片段RT-PCR扩增51-56
• 4.3.5 病毒形态学观察结果56
• 4.3.6 病毒TCID50测定结果56-57
• 4.3.7 血清中和实验结果57-58
• 4.3.8 病毒中和实验结果58-59
• 4.4 讨论59-61
• 第5章 结论61-62
• 参考文献62-69
• 致谢69-70
• 作者简历70

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