禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究

发布时间：2017-04-02 22:20

  本文关键词：禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及其在雏鸡体内的组织分布研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽脑脊髓炎(avian encephalomyelitis,AE)是由禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)引起的,以幼禽头颈部快速震颤和共济失调等神经症状为主要特征的接触性传染病,成年鸡为亚临床症状,表现为一过性产蛋下降和种蛋孵化率降低。AEV是单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,震颤病毒属成员。该病自1932年首次在美国发现以来,已经传播至全球多个国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失。目前该病尚未有特定的治疗方法,只能依靠疫苗免疫进行预防控制。因此,研究AEV在雏鸡体内的组织分布对于AEV的致病机制研究有着重要意义。本研究对AEV咸阳株进行了分离鉴定,并运用荧光定量PCR和免疫组织化学方法测定了AEV XY13感染雏鸡后病毒在雏鸡体内的动态分布,获得以下结果:1.采集咸阳市某鸡场疑似AE感染雏鸡的脑组织进行病原的分离鉴定,经SPF鸡胚传代、免疫组织化学试验和动物回归试验,初步鉴定分离毒为禽脑脊髓炎病毒,并命名为AEV XY13。根据AEV 1143株VP1基因高度保守区设计特异性引物,经RT-PCR扩增,克隆至pMD19-T载体,转化DH 5α感受态细胞,然后进行序列测定,并与已知参考毒株进行遗传进化分析。结果表明,扩增的VP1目的片段长度为288 bp,编码96个氨基酸残基;AEV XY13与参考毒株的核苷酸同源性为74.6%~99.7%,氨基酸同源性为76.0%~97.9%;遗传进化分析结果表明,AEV XY13与SX株处于相同的分支;与1143、YL、L2Z株则同处于一个较大的分支上,亲缘关系较近,而与Van Roekel、NH-937和204C株则处于不同的分支上,亲缘关系较远;遗传进化距离估算结果表明,AEV XY13与1143、L2Z、SX和YL株的进化距离均小于0.011,而与NH-937、Van Roekel和204C株的进化距离则大于0.060。2.用荧光定量PCR测定AEV在雏鸡体内不同组织的病毒载量。将AEV病毒液以10倍梯度逐级递减稀释至10-7,卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚,12天后收胚,观察并记录每个稀释度的鸡胚病变情况,计算病毒EID50。55只1日龄SPF雏鸡随机分成两组,试验组33只雏鸡每只口服接种105EID50病毒液,对照组22只雏鸡每只口服接种等量的PBS,观察并记录雏鸡生长状况。在接种后第2天、第4天、第6天、第7天、第8天、第10天、第12天、第15天、第18天、第22天和第24天随机选取试验组3只雏鸡和对照组2只雏鸡处死,采集脑、肝、肠、腺胃、法氏囊、脾和肾等组织器官,运用荧光定量PCR方法测定各器官内的病毒载量。结果表明,试验组雏鸡在攻毒后第6天,5只雏鸡开始出现AE临床症状,1只在发病后第2天死亡,攻毒后10天,发病雏鸡的神经症状逐步消失并恢复正常。病毒载量检测结果显示,病毒感染第2天就能在脑、肝脏、肠道、腺胃、法氏囊、脾和肾等被检器官中检测到病毒,且脑组织中的病毒载量最低;感染后6天,脑组织中病毒载量达到峰值,此时试验组部分雏鸡开始出现AE临床症状;肠道、腺胃等消化器官中的病毒载量在整个试验阶段基本保持平稳,而肝脏在感染前期逐步下降后到后期有所回升,表明AEV对胃肠道等消化器官具有较强的组织嗜性;法氏囊和脾脏等免疫器官中的病毒载量呈波动状态;肾脏中的病毒载量逐步下降。3.免疫组织化学试验检测病毒感染雏鸡第2天、第7天和第12天,脑、肝脏、肠道、腺胃、法氏囊、脾脏和肾脏等组织中病毒抗原在各器官中的定位,估算各组织中病毒抗原相对表达量,并分析第2天、第7天和第12天各组织中病毒载量与病毒蛋白相对表达量的相关性。结果显示,在病毒感染第2天、第7天和第12天各组织器官中均有大量的棕黄色阳性着色,表明在相应的组织中均有大量病毒定殖。相关性分析结果表明,病毒感染第2天、第7天和第12天各组织中的病毒蛋白相对表达量与病毒载量呈正相关。综上所述,AEV XY13株与SX、YL、1143和L2Z株的亲缘关系最近,而与NH-937、Van Roekel和204C株的亲缘关系较远,表明AEV XY13株与参考毒株相比,在遗传进化关系上存在一定的差异。组织器官中病毒载量测定结果表明,AEV对胃肠道等消化器官的组织嗜性较强,而对神经系统、免疫系统和泌尿系统等器官的嗜性则较弱。相关性分析结果表明,各器官中病毒蛋白相对表达量与病毒载量呈正相关,病毒载量与病毒蛋白抗原表达量呈对应关系,可以准确反映病毒的组织分布,为病毒的致病机理研究提供依据。
【关键词】：禽脑脊髓炎病毒 遗传进化 荧光定量PCR 病毒载量 免疫组织化学 病毒抗原
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-14
• 文献综述14-24
• 第一章 禽脑脊髓炎研究进展14-24
• 1.1 禽脑脊髓炎病毒研究进展14-20
• 1.1.1 AEV的生物学特征14-15
• 1.1.2 AEV的增殖15
• 1.1.3 AEV基因组15-16
• 1.1.4 AEV VP1基因及其编码的蛋白16
• 1.1.5 AEV的分类16-17
• 1.1.6 AEV检测方法17-18
• 1.1.7 AE流行病学18
• 1.1.8 AE的临床诊断18
• 1.1.9 AE与其他疾病的鉴别诊断18-20
• 1.1.10 AE的预防控制20
• 1.2 禽脑脊髓炎病毒在动物体内的分布研究20-24
• 1.2.1 AEV的致病性研究20-21
• 1.2.2 AEV的分布研究21-22
• 1.2.3 荧光定量PCR在病原体检测中的应用22-24
• 试验研究24-49
• 第二章 禽脑脊髓炎病毒咸阳株的分离鉴定及遗传进化分析24-35
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 病料采集24
• 2.1.2 实验动物及血清24
• 2.1.3 试剂24-25
• 2.1.4 引物合成25
• 2.1.5 AEV参考毒株25
• 2.1.6 主要试剂与培养基的配制25
• 2.1.7 主要仪器25-26
• 2.2 方法26-30
• 2.2.1 病毒增殖26
• 2.2.2 免疫组织化学试验26
• 2.2.3 动物回归试验26
• 2.2.4 病毒基因的RT-PCR扩增26-28
• 2.2.5 目的基因的克隆28-30
• 2.3 结果30-33
• 2.3.1 鸡胚病理变化30
• 2.3.2 免疫组织化学检测结果30
• 2.3.3 动物回归试验结果30-31
• 2.3.4 PCR扩增结果31
• 2.3.5 重组质粒鉴定结果31
• 2.3.6 AEV XY13 VP1片段的序列测定31
• 2.3.7 AEV XY13 VP1基因的同源性分析31-32
• 2.3.8 AEV XY13 VP1基因的遗传进化分析32
• 2.3.9 遗传进化距离比较32-33
• 2.4 讨论33-34
• 2.5 小结34-35
• 第三章 禽脑脊髓炎病毒在雏鸡体内不同组织病毒载量的测定35-41
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 病毒35
• 3.1.2 实验动物35
• 3.1.3 主要试剂35
• 3.1.4 引物35
• 3.1.5 主要仪器35-36
• 3.2 方法36-37
• 3.2.1 病毒的增殖36
• 3.2.2 EID50的测定36
• 3.2.3 病料采集36
• 3.2.4 病毒RNA的提取36
• 3.2.5 cDNA合成36-37
• 3.2.6 实时荧光定量PCR37
• 3.2.7 数据统计分析37
• 3.3 结果37-39
• 3.3.1 EID50测定结果37
• 3.3.2 雏鸡临床观察37
• 3.3.3 RNA纯度测定37-38
• 3.3.4 AEV在雏鸡体内的病毒载量测定结果38-39
• 3.4 讨论39-40
• 3.5 小结40-41
• 第四章 禽脑脊髓炎病毒在雏鸡体内不同组织分布研究41-49
• 4.1 材料41-42
• 4.1.1 病毒41
• 4.1.2 血清41
• 4.1.3 实验动物41
• 4.1.4 主要试剂41
• 4.1.5 主要溶液配制41-42
• 4.1.5 主要试验仪器42
• 4.2 方法42-44
• 4.2.1 病料采集42
• 4.2.2 载玻片处理42
• 4.2.3 石蜡切片的制作42-43
• 4.2.4 免疫组织化学染色43-44
• 4.2.5 病毒蛋白相对表达量的计算44
• 4.2.6 数据统计分析44
• 4.3 结果44-47
• 4.3.1 一抗最佳稀释度的确定44
• 4.3.2 DAB显色时间的确定44
• 4.3.3 免疫组织化学结果44-46
• 4.3.4 病毒蛋白相对表达量计算结果46-47
• 4.4 讨论47-48
• 4.5 小结48-49
• 结论49-50
• 参考文献50-56
• 缩略词表56-57
• 致谢57-58
• 作者简介58

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本文编号：283265