Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对鹅肝细胞脂质沉积的影响研究

发布时间：2017-04-02 22:17

  本文关键词：Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对鹅肝细胞脂质沉积的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：机体内脂质代谢平衡被破坏,就会引起大量的的脂质在肝脏内沉积形成脂肪肝。Sirtl基因在脂质代谢中起着重要的调控作用,但其具体调控机制还不明确；PI3K-Akt-mTOR信号通路参与调控糖脂代谢等新陈代谢活动,而其具体机理也是目前的研究热点之一；两者在脂质调控中是否存在相互作用,目前鲜见报道,因此本试验通过不同浓度的尼克酰胺(Nicotinamide)处理鹅原代肝细胞,检测Sirt1和脂质代谢关键因子的表达变化；然后在选出的最佳尼克酰胺浓度处理鹅原代肝细胞的基础上,添加不同的PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂LY294002、NVP-BEZ235、雷帕霉素(Rapamycin)处理培养,检测脂肪酸合成与氧化、VLDL的生成和分泌、PI3K-Akt-mTOR信号通路关键因子和Sirt1本身的表达变化,分析Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径调控脂质代谢的机理。主要研究结果如下：1.不同浓度尼克酰胺处理鹅原代肝细胞,Sirtl的mRNA表达水平和蛋白浓度随着尼克酰胺浓度升高而降低；尼克酰胺处理浓度为100μmol/L时,Sirt1蛋白浓度为对照组的51.50%;2.不同浓度尼克酰胺处理肝细胞,促进脂肪酸合成关键因子SREBP1、FAS、ACCa表达(P0.05),抑制脂肪酸氧化关键因子PPARα、PPARγ、ACOX1、CPT1的表达(P0.05),下调脂质转运关键因子FoxO1、MTTP、DGAT1、DGAT2的表达水平(P0.05)；尼克酰胺处理也能增加胞内TG含量(P0.05),减少VLDL和胞外TG含量(P0.05),诱导肝细胞内脂滴增大增多、脂质含量上升(P0.05),脂质沉积增加;3.鹅肝细胞添加100μmol/L的尼克酰胺处理后,PI3K-Akt-mTOR信号通路关键因子P13K的表达被抑制(P0.05), mTOR表达被上调(P0.05), Akt1表达无显著性变化(P0.05)；再添加通路抑制剂LY294002时,mTOR、Akt1表达被下调,PI3K表达与尼克酰胺单独处理无显著性差异；而当再添加通路抑制剂Rapamycin时,mTOR、Akt表达降低,而PI3K表达较尼克酰胺单独处理显著升高；当在添加NVP-BEZ235双重抑制信号通路时,Akt表达与对照组无显著性差异,mTOR被下调,PI3K表达较尼克酰胺单独处理无显著性差异。再添加NVP-BEZ235抑制剂时,Sirt1表达与尼克酰胺单独处理无显著性差异,而当再添加另外两种通路抑制剂时,Sirtl表达显著降低(P0.05)；4.最佳浓度100μmol/L的尼克酰胺处理鹅肝细胞,抑制Sirtl表达,导致脂肪酸合成关键因子表达增加；而添加通路抑制剂LY29002、NVP-BEZ235、Rapamycin时,脂肪酸合成关键因子表达被显著下调(P0.05),而且NVP-BEZ235的效果最强；5.通路抑制剂LY294002、NVP-BEZ235和尼克酰胺共处理鹅肝细胞,能减弱尼克酰胺单独处理对脂肪酸氧化关键因子的抑制效果,而且添加NVP-BEZ235的这种减弱效果更强；但是脂肪酸氧化关键因子CPTl蛋白表达上却是添加LY294002时最高(P0.05)；6.脂质转运关键因子能被尼克酰胺所抑制,当再添加抑制剂LY294002、 NVP-BEZ235和Rapamycin时,脂质转运关键因子表达被进一步下调；但是,DGAT1的mRNA表达水平在添加LY294002时被显著上调了(P0.05)；同样FoxO1的mRNA表达水平和蛋白浓度在添加NVP-BEZ235处理时显著升高(P0.05);7.100μmol/L的尼克酰胺能显著提高肝细胞活性,增加肝细胞内TG等脂质的含量,减少VLDL的生成分泌和胞外TG含量；当添加通路抑制剂LY294002、NVP-BEZ235时,细胞活性变化不大,肝细胞内TG等脂质含量显著降低(P0.05),VLDL和胞外TG含量高于尼克酰胺单独处理组；而添加通路抑制剂Rapamycin时, VLDL和胞外TG含量最低：油红O染色发现,添加通路抑制剂之后,肝细胞内脂滴减少变小,脂质含量降低(P0.05),肝细胞内脂质沉积作用减弱；
【关键词】：Sirt1 尼克酰胺 PI3K-Akt-mTOR 脂质代谢
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S835
【目录】：

• 摘要5-7
• Summary7-10
• 符号说明10-13
• 1 文献综述13-17
• 1.1 Sirt1基因概述13-14
• 1.2 Sirt1与脂质代谢14-15
• 1.3 Sirt1与PI3K-Akt-mTOR信号途径的相互作用15-16
• 1.4 本研究的目的和意义16-17
• 2 材料和方法17-30
• 2.1 材料17-20
• 2.1.1 试验动物材料17
• 2.1.2 试验主要仪器17-18
• 2.1.3 试验主要药品18-19
• 2.1.4 试验主要试剂盒19
• 2.1.5 试验主要药品的配制19-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 试验动物饲养20-21
• 2.2.2 细胞培养21-22
• 2.2.3 总RNA的提取及质量检测22-23
• 2.2.4 反转录获取cDNA23-24
• 2.2.5 定量引物设计及合成24-25
• 2.2.6 荧光定量PCR25-26
• 2.2.7 CCK-8试剂盒检测细胞活性26-27
• 2.2.8 油红O染色检测脂质含量27
• 2.2.9 总蛋白的获取及浓度测定27-28
• 2.2.10 目的蛋白浓度检测28-29
• 2.2.11 Western Blot检测蛋白表达29-30
• 2.2.12 试验数据分析30
• 3 结果及分析30-52
• 3.1 Sirt1抑制剂尼克酰胺对鹅肝细胞脂质代谢的影响30-40
• 3.1.1 尼克酰胺最佳抑制浓度的筛选30
• 3.1.2 Sirt1抑制剂尼克酰胺对鹅肝细胞细胞内外脂质含量的影响30-34
• 3.1.3 尼克酰胺对脂肪酸合成、脂肪酸氧化及脂质转运途径关键因子的影响34-40
• 3.2 Sirt1对PI3K-Akt-mTOR信号通路活性的影响40-42
• 3.3 Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对脂质代谢的影响42-52
• 3.3.1 Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对细胞内外脂质含量的影响42-46
• 3.3.2 Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对脂肪酸合成、脂肪酸氧化及脂质转运途径关键因子的影响46-52
• 4 讨论52-60
• 4.1 Sirt1在脂质沉积中的调控作用52-54
• 4.2 Sirt1对PI3K-Akt-mTOR信号通路的调控作用54-56
• 4.3 Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对脂质代谢的调控作用56-60
• 4.3.1 Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径调控脂质合成和氧化56-58
• 4.3.2 Sirt1通过PI3K-Akt-mTOR信号途径对脂质转运的调控58-60
• 5 结论60-61
• 参考文献61-69
• 致谢69-70
• 攻读学位期间发表的学术论文目录70

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