转Nramp1基因克隆牛的研制

发布时间：2020-10-26 22:38

【摘要】：结核病是一种全球性的、人畜共患传染病,是严重危害养殖业和人类健康的重大疫病之一。由于没有有效的预防和根除方法,目前主要采用检疫-扑杀结合的方法。结核病的发生与机体的抗病力密切相关,因而,如何提高机体的抗结核能力一直是人们关注的焦点。近年来,病原-宿主相关作用机制研究的深入、基因编辑技术和动物克隆技术的快速发展,使抗结核牛羊的培育和生产成为可能。研究显示,机体对结核分支杆菌的抵抗力强弱与天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的表达存在量依赖性关系。因此通过转基因手段来增强牛Nramp1基因表达,培育抗病种群,可成为控制牛结核病的一个新切入点。本研究分别克隆了秦川牛Nramp1开放阅读框及荷斯坦奶牛Nramp1基因启动子区(5’侧翼区-1483~+73)序列,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性真核表达载体,转染荷斯坦奶牛新生牛成纤维细胞,筛选阳性克隆作为核移植供体细胞,生产培育转Nramp1基因克隆牛,取得以下结果:1.基因克隆、载体构建与功能验证。以秦川牛外周血总RNA为模板PCR扩增Nramp1基因开放阅读框,获得的序列对比Gen Bank中的牛的相应的基因序列(Gen Bank序列号U12862.1),发现存在2个碱基差异:第1个差异碱基致使基因编码的第49个氨基酸发生变化使苏氨酸(ACA)转变为丙氨酸(GCA);第2个差异碱基并未引起其编码氨基酸的差异,即第53位氨基酸均为精氨酸(AGG→CGG)。荷斯坦奶牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列在巨噬细胞内有启动子活性,且H37Ra可以诱导调节该区段的启动子活性。使用牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列调控Nramp1基因表达,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体p Lox P-2A-N。载体p Lox P-2A-N中使用FMDV 2A自剪肽连接GFP与Neo基因,并在细胞筛选标记基因两侧添加同向的Lox P位点。将该片段分别转入E.coli BM25.8菌株和HEK293,经菌体Cre酶及Cre酶细胞共孵育实验均证明在Cre酶的作用下,Lox P可有效去除中间的筛选标记基因,但序列中会残存一个Lox P位点。2.转基因细胞株的筛选与鉴定。线性化载体p Lox P-2A-N转染奶牛成纤维细胞获得转Nramp1基因细胞株D4、E3。Q-PCR鉴定2株细胞外源基因拷贝数为1。染色体步移试验检测出D4株外源基因插入第29号染色体、E3外源基因插入第10号染色体,两细胞株外源基因插入位点均位于基因组非编码区内。细胞核型试验证明2株细胞染色体数目均为60条。3.核移植与转基因牛生产、鉴定。以D4、E3作为核移植供体细胞生产的转Nramp1基因重构胚胎体外及体内发育率正常,获得3头犊牛(大于2月龄)经PCR与Soutern Blot鉴定均为转Nramp1基因克隆牛。Q-PCR分析外源基因插入没有影响其插入位点上下游基因m RNA的表达水平。分离转基因牛与非转基因牛(供体细胞来源)外周血单核细胞诱导为巨噬细胞。结核分支杆菌H37Ra侵染牛MDMs。正常培养条件下,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量与非转基因牛差异不显著;攻菌后,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量显著高于非转基因牛。攻菌3 d后,转基因牛MDMs细胞荷菌数显著低于非转基因牛。说明秦川牛Nramp1基因的转入增强了荷斯坦奶牛MDMs对结分支核菌的抑制与杀伤作用,即转入Nramp1增强了牛对结核分支杆菌的抵抗能力。4.SCNT胚胎早期发育阶段体外培养体系的确立。通过SCNT检测胚胎发育率、囊胚细胞总数、ROS水平、囊胚细胞凋亡率和ICM比例指出牛SCNT胚胎体外培养全程添加Vit-C可以提高胚胎卵裂率但降低囊胚孵化率,降低了胚胎质量与发育能力。在转基因牛培育过程中不适宜使用Vit-C作为添加剂。综上所述,本研究获得3头转Nramp1基因克隆牛,完善了转基因牛生产技术体系。从增强动物体自身天然免疫力角度出发,通过转基因手段培育抗病种群,为牛结核病的防控创造一个新切入点。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S858.23
【文章目录】：
摘要
Abstract
文献综述
    第一章 影响机体抵抗分支杆菌感染的遗传因素
        1.1 天然免疫力相关巨噬细胞蛋白 1
        1.2 细胞内病原抗性基因 1
        1.3 γ-干扰素受体及信号通路
        1.4 维生素D及其受体
        1.5 人类白细胞抗原
        1.6 巨噬细胞移动抑制因子
        1.7 全基因组关联研究
        1.8 展望
    第二章 Nramp1 研究进展
        2.1 Nramp基因家族
        2.2 Nramp1 基因抗结核研究
            2.2.1 机体免疫力与结核分支杆菌的相互作用
            2.2.2 Nramp1 基因多态性研究
            2.2.3 缺氧诱导因子 1α 与Nramp1
        2.3 Nramp1 基因转录调控
            2.3.1 Nramp1 近端启动子
            2.3.2 组蛋白修饰模式
            2.3.3 Nramp1 表达调控元件
        2.4 本研究的内容及意义
试验研究
    第三章 Nramp1 细胞特异性表达载体构建及启动子活性分析
        3.1 材料
            3.1.1 实验动物和组织细胞
            3.1.2 菌株和质粒
            3.1.3 主要试剂
            3.1.4 测试化验加工
            3.1.5 引物设计
        3.2 方法
            3.2.1 筛选报告基因序列扩增及功能检测
            3.2.2 载体pLoxP-2A-A的构建
            3.2.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因启动子区扩增及活性检测
            3.2.4 Nramp1 细胞特异性表达载体pLoxP-2A-N载体构建及其功能验证
        3.3 结果
            3.3.1 筛选报告基因序列扩增及功能检测
            3.3.2 载体pLoxP-2A-A的构建
            3.3.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因启动子区扩增及活性检测
            3.3.4 Nramp1 细胞特异性表达载体pLoxP-2A-N构建及其功能验证
        3.4 讨论
        3.5 结论
    第四章 转牛Nramp1 基因成纤维细胞株筛选及鉴定
        4.1 材料
            4.1.1 实验动物和组织细胞
            4.1.2 菌株和质粒
            4.1.3 主要试剂
            4.1.4 引物设计
        4.2 方法
            4.2.1 新生荷斯坦奶牛成纤维细胞的分离培养
            4.2.2 转Nramp1 基因成纤维细胞筛选
            4.2.3 转Nramp1 基因成纤维细胞株鉴定
        4.3 结果
            4.3.1 新生荷斯坦奶牛成纤维细胞的分离培养
            4.3.2 转Nramp1 基因成纤维细胞筛选
            4.3.3 转Nramp1 基因成纤维细胞鉴定
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 转Nramp1 基因牛的生产与鉴定
        5.1 材料
            5.1.1 实验动物和组织细胞
            5.1.2 菌株和质粒
            5.1.3 主要试剂
            5.1.4 引物设计
        5.2 方法
            5.2.1 SCNT胚胎体外培养条件优化
            5.2.2 转Nramp1 基因重构胚的培养
            5.2.3 转Nramp1 基因牛生产及鉴定
        5.3 结果
            5.3.1 培养液添加Vit-C对牛SCNT胚胎发育的影响
            5.3.2 转Nramp1 基因克隆胚的制备
            5.3.3 转Nramp1 基因克隆牛的生产
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论
创新之处与进一步研究的课题
参考文献
附录
缩略 词
致谢
作者简介

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：2857613