猪δ冠状病毒非结构蛋白nsp15抑制IFN-β产生的机制研究
发布时间：2020-10-26 23:13
猪δ冠状病毒(PDCoV)是近年发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起仔猪腹泻和肠道损伤。PDCoV为有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目,冠状病毒科,δ冠状病毒属成员。全长基因组约25.4 kb,其基因组序列为5?UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3?UTR,编码15个非结构蛋白(nsp2-nsp16),4个结构蛋白和3个特异性辅助蛋白。研究证实感染脊椎动物的套式病毒目病毒(冠状病毒科和动脉炎病毒科)编码的内切核糖核酸酶(又称为NendoU)较为保守,在病毒的复制和转录中起着关键作用,并且已证实部分冠状病毒的内切核糖核酸酶(nsp15)和动脉炎病毒的同源蛋白nsp11能够拮抗干扰素(IFN)的产生。我们之前的研究发现PDCoV通过抑制RIG-I信号转导拮抗IFN-β的产生,而PDCoV nsp15是否参与拮抗IFN-β的产生尚不清楚。基于此,本课题以PDCoV nsp15作为研究对象,探究其对IFN-β产生的影响以及具体的作用机制。主要研究内容如下:1.PDCoV nsp15呈剂量依赖性抑制IFN-β的产生将不同剂量的PDCoV nsp15真核表达质粒与IFN-β荧光素酶报告质粒IFN-β–Luc、内参质粒pTK-Luc分别共转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析和RT-PCR检测,发现PDCoV nsp15显著抑制仙台病毒(SeV)诱导的IFN-β启动子激活以及IFN-βmRNA表达,并且呈剂量依赖性,提示PDCoV nsp15具有拮抗IFN-β产生的特性。2.PDCoV nsp15主要抑制NF-κB的活化IRF3和NF-κB是调控IFN-β产生的关键转录因子,为了探究PDCoV nsp15是否影响它们的活化从而拮抗IFN-β的产生,将nsp15的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现nsp15显著抑制SeV诱导的NF-κB活化并呈剂量依赖性,但对SeV诱导的IRF3的活化无显著影响;IRF3和p65的磷酸化及其核转运分别是IRF3和NF-κB激活的标志,Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明nsp15蛋白主要抑制SeV诱导的p65磷酸化和入核,不影响IRF3的磷酸化和入核。表明PDCoV nsp15主要通过抑制NF-κB的活化拮抗IFN-β的产生。3.PDCoV nsp15的关键酶活位点为His219、His234和Lys269根据PDCoV和其他冠状病毒nsp15的氨基酸序列同源性比对及结构同源性分析,推测PDCoV的NendoU结构域活性催化氨基酸位点为His219(H219)、His234(H234)和Lys269(K269)。通过定点突变的方法获得3个突变的nsp15基因,并将其和野生型nsp15基因分别克隆至原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6P-1-nsp15以及相应的突变体质粒(pGEX-6P-1-H219A/H234A/K269A),经IPTG诱导表达、纯化后,利用荧光共振能量转移试验(FRET)分析发现,与nsp15野生型蛋白相比,3个突变体蛋白的NendoU活性显著降低,说明His129、His234和Lys269是PDCoV nsp15的关键酶活位点。4.PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生不依赖其内切核糖核酸酶活性有报道某些冠状病毒nsp15和动脉炎病毒nsp11拮抗I型IFN的产生依赖其内切核糖核酸酶活性;也有研究表明动脉炎病毒nsp11潜在的细胞毒性会影响IFN的产生。为了探讨PDCoV nsp15对IFN-β产生的抑制作用是否依赖于其内切核糖核酸酶活性及细胞毒性,首先检测了PDCoV nsp15野生型和突变体的细胞毒性,发现野生型对细胞有一定的毒性作用,3种突变体对细胞几乎没有毒性。在此基础上,将表达PDCoV nsp15野生型及突变体(H219A、H234A和K269A)的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现,3个突变体与野生型一样均显著抑制SeV诱导的IFN-β产生,相互之间无显著差异;且主要抑制p65的磷酸化,而对IRF3的磷酸化无显著影响。进一步以突变体H234A为代表,检测了nsp15突变体对内源性IRF3和p65核转运的影响,结果与nsp15野生型一样,突变体H234A抑制了SeV诱导的p65入核,但不影响IRF3的入核。上述结果表明PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生和NF-κB的活化不依赖其内切核糖核酸酶活性,也不是其细胞毒性所致。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：
激活了RLRs信号转导，诱导 I型IFN的产生和抗病毒信号转导在宿主细胞拮抗冠状病毒的感染中发挥重要作用守的 DExD/H 结构的 RNA 依赖的 ATP 水解酶（ATPase）IG-I（Retinoic acid-inducible gene I）、MDA5（melanomaGP2（laboratory of genetics and physiology 2）三个成员， RNA 病毒(Yoneyama et al 2005)。当病毒 RNA 被 RIG-I/MAVS 依赖的抗病毒信号传递，活化的 RIG-I/MDA5 与 R蛋白 MAVS 相互作用(Seth et al 2005)，使 MAVS 活化聚形成 MAVS 信号小体，随后分成两条信号传递，一方面AF-2/6 与肿瘤坏死因子受体相互作用，激活 IKK -IKKβ-IK因子 κB（NF-κB）活化(Takaoka et al 2005, Vallabhapurapu 一方面通过 TRAF3 将下游的 TBK1 和 IKK 激活，协助 的磷酸化以及二聚体形成(Paz et al 2011)。活化的 IRF3/I转录共激活因子 CBP（CREB binding protein）/p300 结FN-β 转录，建立细胞的抗病毒状态(Yoneyama et al 1998)（
第 4 章 结果与分析4.1 PDCoV nsp15 抑制 SeV 诱导的 IFN-β 产生为了探究 PDCoV nsp15 对 I 型 IFN 产生的影响，将不同剂量的 PDCoV nsp15真核表达质粒 pCAGGS-HA-nsp15 与荧光素酶报告质粒 IFN-β-Luc 和内参质粒pRL-TK 共转染 24 孔细胞培养板长满单层的 LLC-PK1/HEK-293T 细胞，并设立相应的空载体 pCAGGS-HA 作为阴性对照，24 h 后感染 SeV，12 h 后收样，检测双荧光素酶活性。结果发现 SeV 显著诱导了 IFN-β 启动子激活，而 PDCoV nsp15 呈剂量依赖性抑制 SeV 诱导的 IFN-β 启动子激活（图 4-1A 和 4-1C）。进一步将pCAGGS-HA-nsp15 转染 LLC-PK1/HEK-293T 细胞上，24 h 后感染 SeV，12 h 后收样，提取细胞总 RNA，通过荧光定量 RT-PCR 检测 IFN-β mRNA 水平的表达，结果显示，PDCoV nsp15 能在 mRNA 水平上显著抑制 SeV 诱导的 IFN-β 产生（图 4-1B和 4-1D）。这些结果表明 PDCoV nsp15 显著抑制 SeV 诱导的 IFN-β 产生，并呈剂量依赖性。
猪 冠状病毒非结构蛋白 nsp15 抑制 IFN-β 产生的机制研究4.2 PDCoV nsp15 主要抑制 NF-κB 的活化4.2.1 PDCoV nsp15 抑制 SeV 诱导的 NF-κB 激活IRF3 和 NF-κB 是 I 型干扰素信号通路中重要的转录因子，因此我们进一步探究PDCoV nsp15 对 SeV 诱导的 IRF3 和 NF-κB 活化的影响。将不同剂量的pCAGGS-HA-nsp15 真核表达质粒与报告质粒 pRL-TK、IRF3-Luc 或 NF-κB-Luc 共转染 LLC-PK1/HEK-293T 细胞，24 h 后感染 SeV，12 h 收取样品进行双荧光素酶活性分析。结果显示 PDCoV nsp15 显著抑制 SeV 诱导的 NF-κB 激活，呈剂量依赖性（图 4-2C 和 4-2D）；但对 SeV 诱导的 IRF3 激活无显著影响（图 4-2A 和 4-2B）。
【相似文献】
本文编号：2857660
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：
激活了RLRs信号转导，诱导 I型IFN的产生和抗病毒信号转导在宿主细胞拮抗冠状病毒的感染中发挥重要作用守的 DExD/H 结构的 RNA 依赖的 ATP 水解酶（ATPase）IG-I（Retinoic acid-inducible gene I）、MDA5（melanomaGP2（laboratory of genetics and physiology 2）三个成员， RNA 病毒(Yoneyama et al 2005)。当病毒 RNA 被 RIG-I/MAVS 依赖的抗病毒信号传递，活化的 RIG-I/MDA5 与 R蛋白 MAVS 相互作用(Seth et al 2005)，使 MAVS 活化聚形成 MAVS 信号小体，随后分成两条信号传递，一方面AF-2/6 与肿瘤坏死因子受体相互作用，激活 IKK -IKKβ-IK因子 κB（NF-κB）活化(Takaoka et al 2005, Vallabhapurapu 一方面通过 TRAF3 将下游的 TBK1 和 IKK 激活，协助 的磷酸化以及二聚体形成(Paz et al 2011)。活化的 IRF3/I转录共激活因子 CBP（CREB binding protein）/p300 结FN-β 转录，建立细胞的抗病毒状态(Yoneyama et al 1998)（
第 4 章 结果与分析4.1 PDCoV nsp15 抑制 SeV 诱导的 IFN-β 产生为了探究 PDCoV nsp15 对 I 型 IFN 产生的影响，将不同剂量的 PDCoV nsp15真核表达质粒 pCAGGS-HA-nsp15 与荧光素酶报告质粒 IFN-β-Luc 和内参质粒pRL-TK 共转染 24 孔细胞培养板长满单层的 LLC-PK1/HEK-293T 细胞，并设立相应的空载体 pCAGGS-HA 作为阴性对照，24 h 后感染 SeV，12 h 后收样，检测双荧光素酶活性。结果发现 SeV 显著诱导了 IFN-β 启动子激活，而 PDCoV nsp15 呈剂量依赖性抑制 SeV 诱导的 IFN-β 启动子激活（图 4-1A 和 4-1C）。进一步将pCAGGS-HA-nsp15 转染 LLC-PK1/HEK-293T 细胞上，24 h 后感染 SeV，12 h 后收样，提取细胞总 RNA，通过荧光定量 RT-PCR 检测 IFN-β mRNA 水平的表达，结果显示，PDCoV nsp15 能在 mRNA 水平上显著抑制 SeV 诱导的 IFN-β 产生（图 4-1B和 4-1D）。这些结果表明 PDCoV nsp15 显著抑制 SeV 诱导的 IFN-β 产生，并呈剂量依赖性。
猪 冠状病毒非结构蛋白 nsp15 抑制 IFN-β 产生的机制研究4.2 PDCoV nsp15 主要抑制 NF-κB 的活化4.2.1 PDCoV nsp15 抑制 SeV 诱导的 NF-κB 激活IRF3 和 NF-κB 是 I 型干扰素信号通路中重要的转录因子，因此我们进一步探究PDCoV nsp15 对 SeV 诱导的 IRF3 和 NF-κB 活化的影响。将不同剂量的pCAGGS-HA-nsp15 真核表达质粒与报告质粒 pRL-TK、IRF3-Luc 或 NF-κB-Luc 共转染 LLC-PK1/HEK-293T 细胞，24 h 后感染 SeV，12 h 收取样品进行双荧光素酶活性分析。结果显示 PDCoV nsp15 显著抑制 SeV 诱导的 NF-κB 激活，呈剂量依赖性（图 4-2C 和 4-2D）；但对 SeV 诱导的 IRF3 激活无显著影响（图 4-2A 和 4-2B）。
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本文编号：2857660
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