呕吐毒素降解菌的筛
发布时间：2020-10-27 03:39
呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)是由雪腐镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌等镰刀菌所产生的一类毒素,广泛存在于小麦、玉米等饲料原料及成品饲料中,是检出率和超标率最高的一种真菌毒素,对动物和人的危害巨大。微生物发酵处理作为一种安全环保的处理方式,成为研究呕吐毒素降解的热点。本研究旨在筛选出对呕吐毒素降解能力高的微生物菌株,对其进行鉴定培养并应用于饲料原料的生物脱毒处理中。试验从不同环境中采集土壤、淤泥、发霉秸秆、鸡肠道内容物、猪粪、牛粪等样品共10份。将DON添加到LB,NA和MRS固体培养基中以制备用于初始筛选菌株的改良的固体筛选培养基。通过初步筛选获得到的菌株在改良液体培养基培养,并且通过ELISA测量改良培养基中DON的降解率对菌种进行复筛,根据培养基、培养方式和降解率,选择部分分解菌进行形态学观察、革兰氏染色、显微镜镜检和16Sr DNA保守序列分析,确定其种属。组合所筛选和鉴定的菌种,优化出发酵条件,对麸皮和豆粕中的天然DON进行降解实验。研究结果表明:通过初筛筛选到80株能够在初筛培养基生长的菌种,经过复筛筛选到DON降解率从9.7%~66.7%的菌种16株。选择降解率分别为19.1%、51.3%、66.7%的菌种3株,通过菌落特征、菌体特征等形态学观察和16S rDNA保守序列比对的分子鉴定。其中,LB01菌株为乳白色,不透明,表面粗糙,边缘不规则,干燥,有褶皱,菌体呈长杆状,有荚膜,有芽孢,与GeneBank中EnB-alf13(KP792638.1)的相似度达到92%的降解菌为枯草芽孢杆菌;菌株NA06的菌落为乳白色,表面干燥且不透明,中间褶皱边缘不整齐,菌体两端钝圆,呈长杆状,没有伴孢晶体,成对或链排列,孢囊没有明显的肿胀,与GeneBank中MSC46(KM222187.1)的相似度达到99%的降解菌为解淀粉芽孢杆菌;菌株MRS13为乳白色半透明,直径在0.4~2.0 mm,边缘整齐,凸起、光滑且表面湿润,菌体呈短杆状,且其菌体的排列方式有单个和链状排列,无芽孢,与GeneBank中Sourdough-H04(MG754699.1)的相似度达到99%的降解菌为植物乳杆菌。通过单因素试验确定降解麸皮中DON的最优发酵参数为:接种量10 mL/100g,发酵温度37℃,发酵时间48 h。通过不同发酵底物对比试验,发酵麸皮时,枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组合对麸皮中呕吐毒素降解率最高,达71%。相同发酵条件下,解淀粉芽孢杆菌对豆粕中呕吐毒素降解率最高,达82%。
【学位单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S816.3
【部分图文】：
(vomitoxin)学名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DFusarium nigrum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、禾m graminearum）黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）等镰刀菌在结构上是 B 型单端孢霉烯族化合物，广泛存在于被污染[1-3]。DON 第一次被发现是从感染了赤霉病的谷物中由诸罔道。DON 首次被分离到是在 1972 年，日本的 Morooka 等大麦中分离得到，1973 年，Yoshizawa 等从受污染的玉米中其分子结构是雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)的 4-脱氧衍生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(4-deoxynivalenol,DON)，同时研究发现和拒食，所以将其定名为呕吐毒素(Vomitoxin，VT)。徐一纯等赤霉病的大麦中也分离得到一种新的导致拒食和呕吐的毒素2[5]。呕吐毒素的分子式为 C15H2006，呕吐毒素的化学名为 15-三羟基单端孢霉烯-9-烯-8-酮，相对分子质量为量 296.32，1-1 所示。
图 1-2 DON 的 3 个降解靶位Fig. 1-2 3 degradation targets of DON目前研究发现的能够降解呕吐毒素的微生物有酿酒酵母（Saccharomycesrevisiae ）、 红 酵 母 （ Rhodotorula rubra ）、 农 杆 菌 根 瘤 菌Agrobacterium-Rhizobium）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii ssp）、马克斯鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、发酵型肠杆菌（Fermented Enterobacter）杆菌 BBSH797 等。研究者们从多种不同的样品中筛到了不同的降解菌，有鱼脏内容物、土壤、牛瘤胃液以及鸡肠道内容物等[6,48]。这些微生物或其产生的解酶可将呕吐毒素转化为其他低毒的代谢物，甚至可以在以 DON 为唯一碳源培养基上生长。V lkl 等研究推测呕吐毒素分子的 C3-OH 氧化成 3-酮基是辅 NADPH 或 NADH 与乙醇脱氢酶结合作用的结果[49]。Shima 等筛选得到一株土杆菌属根瘤菌 E3-39，可将 DON 代谢为 3-keto-DON。后续研究推测这种转化 E3-39 菌分泌的胞外酶作用的结果[50]。Fuchs 等研究发现，优杆菌属细菌BSH797 可将 DON 转化为唯一产物 DOM-1[51]
B0—0(μg/kg)标准品的平均吸光度值b.标准曲线的绘制与计算标准曲线的横坐标为试剂盒中 5 个标准品浓度的对数，纵坐标为 5 个平均百分吸光度值。将检测样品的百分吸光度值代入到所绘标准曲线中样本处理时所稀释得倍数就能算出样品中 DON 的实际含量。3. DON 降解率计算公式为：降解率=（空白组 DON 含量－样本组 DO白组 DON 含量×100%。.3 试验结果.3.1 菌株的筛选在 LB、NA 和 MRS 中添加 DON，配制成改良固体培养基，采用平板线方法，以好氧和厌氧 2 种方式共得到在培养基上生长的形态不同的单，其中从 LB 培养基中得到 30 株，NA 培养基 23 株，MRS 培养基 27 株筛结果如图 2-1 所示：
【参考文献】
本文编号：2857979
【学位单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S816.3
【部分图文】：
(vomitoxin)学名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DFusarium nigrum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、禾m graminearum）黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）等镰刀菌在结构上是 B 型单端孢霉烯族化合物，广泛存在于被污染[1-3]。DON 第一次被发现是从感染了赤霉病的谷物中由诸罔道。DON 首次被分离到是在 1972 年，日本的 Morooka 等大麦中分离得到，1973 年，Yoshizawa 等从受污染的玉米中其分子结构是雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)的 4-脱氧衍生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(4-deoxynivalenol,DON)，同时研究发现和拒食，所以将其定名为呕吐毒素(Vomitoxin，VT)。徐一纯等赤霉病的大麦中也分离得到一种新的导致拒食和呕吐的毒素2[5]。呕吐毒素的分子式为 C15H2006，呕吐毒素的化学名为 15-三羟基单端孢霉烯-9-烯-8-酮，相对分子质量为量 296.32，1-1 所示。
图 1-2 DON 的 3 个降解靶位Fig. 1-2 3 degradation targets of DON目前研究发现的能够降解呕吐毒素的微生物有酿酒酵母（Saccharomycesrevisiae ）、 红 酵 母 （ Rhodotorula rubra ）、 农 杆 菌 根 瘤 菌Agrobacterium-Rhizobium）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii ssp）、马克斯鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、发酵型肠杆菌（Fermented Enterobacter）杆菌 BBSH797 等。研究者们从多种不同的样品中筛到了不同的降解菌，有鱼脏内容物、土壤、牛瘤胃液以及鸡肠道内容物等[6,48]。这些微生物或其产生的解酶可将呕吐毒素转化为其他低毒的代谢物，甚至可以在以 DON 为唯一碳源培养基上生长。V lkl 等研究推测呕吐毒素分子的 C3-OH 氧化成 3-酮基是辅 NADPH 或 NADH 与乙醇脱氢酶结合作用的结果[49]。Shima 等筛选得到一株土杆菌属根瘤菌 E3-39，可将 DON 代谢为 3-keto-DON。后续研究推测这种转化 E3-39 菌分泌的胞外酶作用的结果[50]。Fuchs 等研究发现，优杆菌属细菌BSH797 可将 DON 转化为唯一产物 DOM-1[51]
B0—0(μg/kg)标准品的平均吸光度值b.标准曲线的绘制与计算标准曲线的横坐标为试剂盒中 5 个标准品浓度的对数，纵坐标为 5 个平均百分吸光度值。将检测样品的百分吸光度值代入到所绘标准曲线中样本处理时所稀释得倍数就能算出样品中 DON 的实际含量。3. DON 降解率计算公式为：降解率=（空白组 DON 含量－样本组 DO白组 DON 含量×100%。.3 试验结果.3.1 菌株的筛选在 LB、NA 和 MRS 中添加 DON，配制成改良固体培养基，采用平板线方法，以好氧和厌氧 2 种方式共得到在培养基上生长的形态不同的单，其中从 LB 培养基中得到 30 株，NA 培养基 23 株，MRS 培养基 27 株筛结果如图 2-1 所示：
【参考文献】
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本文编号：2857979
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