猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗的研制

发布时间：2020-11-02 19:24

　　 猪链球菌病是由猪链球菌(Streptococcus suis,SS)引起的以猪的脑膜炎、败血症、关节炎等临床症状为特征的细菌性传染病。副猪嗜血杆菌病(也称为格拉泽氏病)是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)引起的以猪的脑膜炎、多发性浆膜炎、心包炎和关节炎为特征的细菌性传染病。二者在临床上常见混合感染,给养猪业造成了巨大损失。疫苗是提倡无抗养殖的关键环节,猪链球菌和副猪嗜血杆菌血清型众多,传统的灭活苗型间交叉保护性差,随着多种免疫原性好的抗原蛋白的发现,亚单位疫苗逐渐受到人们的重视。细菌表面展示技术已被证实能将较大的外源片段展示于菌体表面且保持片段生物学活性。本研究的目的在于获得一种基于细菌表面展示的高效、廉价、广谱的猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗,为细菌疫苗的研发提供新思路。本研究构建了重组表面展示质粒pMD-INP-CdtB-OppA、pMD-INP-AfuA-OppA2、pMD-INP-MRP、pMD-INP-AfuA、pMD-INP-OppA2、pMD-INP-CdtB、pMD-INP-OppA,并转入E.coli BL21(DE3),通过亚细胞组分分离定位、免疫电镜实验验证了这8个重组的表面展示质粒能将重组蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY、AfuA、CdtB、OppA2、OppA展示于E.coli BL21(DE3)的菌体表面。将菌体灭活后进行蛋白定量按比例混合并将混合后的菌液与ISA201VG乳化制成二联亚单位疫苗,添加纯化蛋白二联亚单位疫苗组、二联灭活苗组和对照组,在二次免疫小鼠14d后,用副猪嗜血杆菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株和猪链球菌血清2型M126株、血清9型GZ2株以绝对致死剂量分别对小鼠腹腔注射攻毒。结果显示,表面展示HPS融合抗原蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA的亚单位疫苗I对攻副猪嗜血杆菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株的小鼠保护率为(80%、80%),表面展示HPS抗原蛋白AfuA、CdtB、OppA2、OppA的二联疫苗Ⅱ对攻副猪嗜血杆菌血清5型HN10株、血清13型ZD12株的小鼠保护率为(90%、60%),证明将蛋白融合后再进行表面展示策略的可行性。同时,二者对攻HPS小鼠的保护效果优于灭活苗(80%、60%),与纯化蛋白亚单位疫苗基本相当(90%、60%);含SS经典抗原蛋白MRP、SLY的表面展示疫苗对攻SS血清2型M126株、血清9型GZ2株的小鼠的保护率为(50%、90%),低于纯化蛋白亚单位疫苗(100%、80%),但高于灭活苗(50%、60%)。表面展示疫苗刺激小鼠机体产生细胞因子及抗体水平均与纯化蛋白亚单位疫苗相当,其简单的制作过程展现出很好的应用前景。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S859.797
【部分图文】：

、rHP0197、rMRP、rRfeA、rSLY 的免疫原性，需要进行性佐剂 ISA201VG 按等质量比混合后乳化，使乳化完成后再取 4 周龄雌性 KM 小鼠（体重为 21-24 g）60 只，随机201VG 组、rHP0197+ISA201VG 组、rMRP+ISA201VG 组1VG 组共五个免疫组和对照组 PBS+ISA201VG 组，背部皮后 14 d 进行二次免疫，免疫剂量和方式与第一次免疫时d 时对各组小鼠进行断尾采血，分离血清备用。同时用猪链 3×108cfu/只。观察并统计一周内小鼠的生存情况。因 PCR 扩增ZYH33 株基因组为模板，设计引物扩增 fbp、hp0197、mr验证，结果显示 fbp、hp0197、mrp、rfeA、sly 的条带大小6 bp、1497 bp，符合预期。

重组质粒双酶切验证Fig.2-2recombinantplasmids’doubleenzymedigestion

图 2-2 重组质粒双酶切验证Fig.2-2 recombinant plasmids’ double enzyme digestionM:DL15000；1:pET-28a-FBP;2:pET-28a-HP0197;3:pET-28a-MRP;4:pET-28a-RfeA;5:pET-28a-SLY SS 蛋白诱导表达验证构建的重组菌 BL21(DE3)-(pET-28a-FBP)、BL21(DE3)-(pET-22b-HP0197)、8a-MRP)、BL21(DE3)-(pET-28a-RfeA)、BL21(DE3)-(pET-28a-SLY) 诱导后收适量进行SDS-PAGE并转转至PVDF膜，以商品化的鼠的His抗体为一抗进行W图 2-3 显示，证明蛋白能在重组菌内被表达。
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本文编号：2867463