AMHR2对鸡卵泡选择过程中颗粒细胞孕酮合成的影响

发布时间：2020-11-06 14:21

　　 鸡的卵泡发育具有连续发育、有优先等级排列且排卵后没有黄体形成等特点。当卵泡发育遵循一个非常严格的优先等级结构时,就能达到最佳的繁殖效率和产蛋性能。鸡的卵泡选择通常发生在6–8 mm直径的小黄卵泡池中,大约每天会有一个卵泡被选择成为等级卵泡。被选择后卵泡的颗粒细胞开始分化,对促卵泡生成素(follicle stimulate hormone,FSH)的敏感性显著增加,FSH的刺激使颗粒细胞开始分泌孕酮。在哺乳动物卵泡选择的过程中,颗粒细胞对FSH的敏感性被认为受到抗缪勒氏管激素(anti-müllerian hormone,AMH)的抑制,进而抑制窦前卵泡发育。然而,AMH在鸡的卵泡选择中是否发挥着与在哺乳动物中相同的作用仍不清楚。本研究通过添加外源鸡AMH和对AMHR2基因进行特异敲除的手段,改变体外培养的颗粒细胞接受AMH刺激的信号强度,从而研究AMHR2对鸡卵泡选择过程中颗粒细胞孕酮合成的影响,为AMHR2介导的AMH在鸡卵泡选择过程中的调控作用提供理论依据。研究结果如下:1.为了探究外源添加的AMH对鸡卵泡颗粒细胞的影响,本研究在用不同浓度的AMH(0,5,10,20,40,80 ng/mL)处理分离培养自6–8 mm卵泡的颗粒细胞后,通过ELISA和qPCR分别检测培养基中孕酮含量及颗粒细胞中孕酮合成相关基因的表达量。结果表明,20 ng/mL的AMH处理能够增强颗粒细胞中孕酮合成相关基因的表达,AMH在调节卵泡FSH阈值中起关键作用,当AMH处于一个相对敏感的适宜浓度时能够降低FSH阈值,增强FSH对6–8 mm卵泡的刺激,从而影响优势卵泡选择和孕酮合成。2.成功构建了特异打靶鸡AMHR2基因的敲除表达系统,包括一对分别打靶鸡AMHR2基因同一外显子上距离小于30 bp的两个靶位点的敲除表达载体pX330-U6-AMHR2_dBsa I-CBh-hSpCas9和相应的SSA-RPG双荧光报告载体pB-CMV-DsRed-CAG-AMHR2.200bp repeat.Puro-T_2A-GFP。通过转染HEK293T细胞和DF-1细胞检测敲除系统的工作效率,经过Puromycin药物筛选富集阳性DF-1细胞后,在鸡的基因组上成功敲除了AMHR2基因(~60%)。3.利用鸡AMHR2基因敲除表达载体及相应的双荧光报告载体,共转染分离培养自6–8 mm卵泡的颗粒细胞,通过qPCR检测筛选富集后的颗粒细胞中孕酮合成相关基因的表达量,结果表明AMHR2基因与孕酮合成相关基因存在正相关关系。综上所述,在鸡的卵泡颗粒细胞中,AMHR2基因与孕酮合成相关基因存在着正相关关系,其参与调控颗粒细胞孕酮合成的具体分子机制仍需要进一步试验验证。本研究通过分析AMHR2对鸡卵泡选择过程中颗粒细胞孕酮合成的影响,为鸡卵泡选择的调控因子和调控机制提供了理论依据,有助于了解鸡卵泡发育和卵泡选择过程中的分子机理。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S831
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 鸡的卵泡发育
        1.1.1 鸡的卵巢结构与卵泡发育
        1.1.2 鸡的卵泡选择
        1.1.3 鸡卵泡发育过程中颗粒细胞的作用
    1.2 AMH与 AMHR2 的研究进展概述
        1.2.1 AMH在卵泡发育过程中的作用
        1.2.2 AMHR2在AMH信号转导中的作用
    1.3 鸡卵巢中的孕酮合成
    1.4 本研究的目的与意义
第二章 AMH处理对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞的影响
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验动物
        2.1.2 试验试剂及试剂配制
        2.1.3 试验仪器
        2.1.4 引物
    2.2 试验方法
        2.2.1 不同发育阶段卵泡中孕酮合成相关基因表达的检测
        2.2.2 鸡原代颗粒细胞的分离
        2.2.3 鸡原代颗粒细胞的培养
        2.2.4 鸡原代颗粒细胞的传代
        2.2.5 AMH处理体外培养的颗粒细胞
        2.2.6 AMH处理后颗粒细胞培养基中孕酮浓度检测
        2.2.7 检测AMH处理后颗粒细胞中孕酮合成相关基因的表达
    2.3 试验结果
        2.3.1 不同发育阶段卵泡孕酮合成基因的转录表达量
        2.3.2 颗粒细胞培养基中孕酮含量的检测
        2.3.3 颗粒细胞中孕酮合成相关基因的转录表达量
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 鸡AMHR2 基因敲除相关载体的构建与验证
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌株、载体与细胞系
        3.1.2 试验试剂及试剂配制
        3.1.3 试验仪器
        3.1.4 引物
    3.2 试验方法
        3.2.1 鸡AMHR2 基因靶位点的选择
        3.2.2 鸡AMHR2 基因敲除载体的构建
        3.2.3 SSA-RPG双荧光报告载体的构建
        3.2.4 HEK293T细胞的培养与转染
        3.2.5 DF-1 细胞的培养与转染
        3.2.6 Puromycin药物筛选DF-1 细胞
        3.2.7 T7E1 核酸内切酶检测
        3.2.8 TA克隆检测
    3.3 试验结果
        3.3.1 构建鸡AMHR2 基因的敲除表达载体
        3.3.2 SSA-RPG双荧光报告载体的构建
        3.3.3 报告载体水平检测两组敲除表达载体的工作效率
        3.3.4 基因组水平检测两组敲除表达载体的工作效率
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 敲除AMHR2 基因对鸡卵泡颗粒细胞的影响
    4.1 试验材料
        4.1.1 载体与试验动物
        4.1.2 试验试剂及试剂配制
        4.1.3 试验仪器
        4.1.4 引物
    4.2 试验方法
        4.2.1 敲除鸡卵泡颗粒细胞中AMHR2 基因
        4.2.2 Puromycin药物筛选富集阳性颗粒细胞
        4.2.3 敲除AMHR2 基因对颗粒细胞孕酮合成相关基因表达的影响
    4.3 试验结果
        4.3.1 颗粒细胞中报告载体水平上AMHR2 的敲除效率
        4.3.2 Puromycin药物筛选富集阳性颗粒细胞
        4.3.3 敲除AMHR2 后颗粒细胞中孕酮合成相关基因的表达变化
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论
附录
参考文献
致谢
个人简历

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本文编号：2873255