伪狂犬病毒不同毒株间gC蛋白的抗原差异性研究

发布时间：2020-11-08 22:23

　　 伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种对养猪业危害极大的传染病。2011年下半年,PRV变异株在我国免疫猪群中开始流行。本实验室率先分离到变异株,命名为He N1株。研究表明接种现有疫苗株不能使易感动物获得对变异株的完全保护,血清中和试验显示疫苗株Bartha-K61与HeN1株之间存在明显的抗原差异。gC蛋白是PRV重要的中和性抗原,其变异可能会导致疫苗株免疫猪体后产生的中和抗体不能对PRV变异株进行有效的中和。因此我们利用酵母表面展示技术获取疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1 gC蛋白的抗原区,来探究毒株间的抗原性差异。为了解PRV变异株的流行及变异情况,2016~2017年间,对来自安徽、河北、山东等省份的大中型猪场送检的疑似PRV病料进行PCR检测,鉴定出16份PRV阳性病料,对其gC、gE基因进行序列分析,两者氨基酸序列与2012年以来的变异株的相应氨基酸序列同源性分别为98.2%~100%与99.3~100%,与经典株的相应氨基酸序列同源性相对较低,分别为92.5%~94.8%与95.3%~99.1%。变异株的gE蛋白均在第48位和第492位各插入1个天冬氨酸,在gC蛋白的64~70位处连续插入7个氨基酸,分离株具有与变异株相同的分子标记,并且分离的16株PRV与GenBank下载的近年来国内报道的PRV变异毒株在系统进化树上处于同一分支,与经典株位于不同分支,表明HeN1株仍是目前PRV流行毒株的代表毒株。本研究利用DNase I将疫苗株Bartha-K61与变异株He N1的gC基因随机酶切成100~250 bp的小片段,然后连接到酵母展示载体pCTCON2中,将连接产物电转入大肠杆菌DH5α中构建随机的酵母展示文库。提取两个文库的质粒并电转入制备的酿酒酵母EBY-100感受态中进行培养诱导。用抗Bartha-K61与抗HeN1株的猪阳性血清分别对两个诱导表达后的酵母文库进行染色,通过流式细胞仪对阳性酵母进行经两轮分选富集,提取富集后阳性酵母的质粒进行测序分析,通过分析克隆的分布及个数来绘制抗原区图谱。结果显示,HeN1-gC蛋白的主要抗原区位于A1区(23-152位aa)、次要抗原区位于A3区(337-487位aa)、非抗原区位于A2区(153-336位aa);Bartha-K61-gC蛋白的主要抗原区位于B1区(23-130位aa)、次要抗原区位于B2区(131-222位aa)、非抗原区位于B3区(223-480位aa)。将两毒株gC蛋白的各抗原区片段进行酵母展示表达与原核表达,进行流式分析与ELISA分析,结果验证了两毒株gC蛋白的各抗原区的抗原特性,抗原区与血清交叉分析表明两毒株gC蛋白的主抗原区的抗原性差异不大,次要抗原区的抗原性存在差异,非抗原区与血清交叉分析存在一定的抗原性,本研究推测PRV两毒株gC蛋白之间的抗原差异性可能与氨基酸的同源性关系较小,而与病毒自身的调控有关。综上所述,本研究利用酵母展示技术将构建的疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1的gC蛋白抗原文库展示于酵母表面,筛选并鉴定了两毒株gC蛋白的主抗原区与次抗原区,以上研究为揭示PRV毒株间的变异及免疫逃避的机制提供基础。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

学院硕士学位论文 第），G+C 含量高达 73%。病毒基因组包含 UL（110kb）和 US（10kb）两个独是内部重复序列（IRS，15kb）和末端反向重复序列（TRS，15kb） (Ben-Porat el., 2016)。PRV 的基因组包含 73 个开放阅读框，编码 70 多种病毒蛋白，包含、转录调节因子和复制酶等 (刘博涛等，2008)，其中胸苷激酶（TK）、核苷等几种酶是 PRV 重要的毒力基因。

论文 分选抗原的原理两端融合血凝素 HA 标签和 C-myc 标签，用于检测目的蛋抗和抗 C-myc 的抗体检测酵母表面蛋白的展示情况。我出来，来研究基因型与表型的联系。首先将酵母文库与特异体。由于相同种属 IgG 抗体的 FC 配体相同，若选择相对过流式细胞仪进行分选（图 1.3）；若二抗用其他偶联物标的蛋白 (Cochran et al., 2010)。流式细胞仪筛选出的目的蛋母的速度较快，流式细胞仪还可测定酵母展示蛋白的化学al.; 2012)。

图 2.1 PRV 变异株 gE 氨基酸序列插入 2 个天冬氨酸Fig 2.1 Insertion of two aspartic acids in gE gene encoding amino acid for PRV variants
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 赵雪丽;闫若潜;吴志明;曹伟伟;王淑娟;谢彩华;马震原;周兵强;王东方;;鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用[J];中国畜牧兽医;2015年04期

2 杨文萍;顾真庆;孙海凤;董静;侯成才;白娟;姜平;;伪狂犬病毒流行毒株的抗原性和血清中和特性分析[J];畜牧与兽医;2014年10期

3 赵鸿远;彭金美;安同庆;李琳;冷超粮;陈家锃;王倩;常丹;张秋月;蔡雪辉;童光志;田志军;;猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征[J];中国预防兽医学报;2014年07期

4 彭金美;安同庆;赵鸿远;刘益民;陈家锃;冷超粮;孙艳;常丹;田志军;童光志;;猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析[J];中国预防兽医学报;2013年01期

5 杨毅;李文刚;饶宝;张永涛;吕玉金;;猪伪狂犬病疫苗的研究进展[J];江西农业学报;2010年03期

6 黄海彬;程安春;汪铭书;;疱疹病毒糖蛋白C的研究进展[J];中国人兽共患病学报;2010年02期

7 贾俊英;王云波;唐捷;;利用酵母展示系统确定空间构象性抗原表位的方法研究[J];生物化学与生物物理进展;2009年03期

8 翟一凡;邓宁;;酵母表面展示技术应用的研究进展[J];生物学通报;2009年02期

9 刘博涛;宋昌军;刘翊中;;伪狂犬病毒致病机理的研究进展[J];西北民族大学学报(自然科学版);2008年04期

10 肖朝庭,傅衍,田勇;酿酒酵母细胞表面工程应用研究新进展[J];微生物学报;2005年05期

本文编号：2875441