基于毛细管电泳的金黄色葡萄球菌MLVA分型研究及效果评价

发布时间：2020-11-09 08:07

　　 随着我国乳业发展的不断多样化,奶牛乳腺炎的发生率居高不下。由于其病因复杂,临床症状明显,近年来隐性乳腺炎病例逐年增多,已逐渐成为一种难以治疗的疾病。金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的致病病原微生物之一,易对抗生素产生耐药性,临床治疗效果不明显。细菌的分离鉴定是确定病原微生物应用最广的方法,分子分型方法近年来已广泛应用于病原菌流行病学研究,不同地区金黄色葡萄球菌的分子分型具有差异性。因此,可利用分子分型方法对金黄色葡萄球菌流行菌株的进化方式和传播途径做进一步的探究。本研究从吉林省部分地区患奶牛乳腺炎的乳样中分离获得金黄色葡萄球菌,并建立基于毛细管电泳的MLVA分子分型方法。共采集吉林省15个奶牛场患有奶牛乳腺炎且未经药物治疗的乳样300份,经分离纯化、革兰氏染色镜检和OptiRead自动微生物鉴定系统分离出156株革兰氏阳性菌,其中金黄色葡萄球菌18株,最后分型成功的为11株。同时对所有金黄色葡萄球菌选取13种抗生素进行药敏分析,分型成功的11株中显示有2株全耐药的菌株。11株菌对头孢西丁、庆大霉素、青霉素、卡那霉素、克林霉素、氯霉素耐药率为100%,其余抗生素耐药率为:红霉素(72.7%)、四环素(63.6%)、环丙沙星(63.6%)、甲氧氨苄嘧啶(45.4%)、利福平(36.3%)、万古霉素(18.1%)、利奈唑烷(18.1%)。万古霉素和利奈唑烷是对金黄色葡萄球菌敏感的抗生素,但也出现了部分耐药现象。通过8个不同VNTR位点的多态性分析对其进行MLVA分型研究。首先优化PCR反应条件,随后对琼脂糖凝胶电泳的退火温度进行8个反应条件的优化,取每个VNTR位点优化效果最佳的PCR反应产物通过毛细管电泳法进行基因分型。参照金黄色葡萄球菌的MLVA分型数据库,将同一菌株在8个VNTR位点上的重复单元次数按照顺序进行编码,构成MLVA简介进行分型。结果成功将11株金黄色葡萄球菌分为四种型别,分别命名为JLSau1、JLSau2、JLSau3、JLSau4。通过基因测序比对,其中JLSau1型与数据库中MT3027型一致,其余3种均有相近型别。将分得四种型别与数据库中的菌株型别进行聚类分析,结果显示四种基因型均具有相近性,JLSau1与JLSau4的相近度最高,JLSau2、JLSau3、JLSau4三者之间具有较高相近性。
【学位单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.23
【部分图文】：

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１．１科玛嘉显色培养基上生长形态??金黄色葡萄球菌在科玛嘉显色培养基上呈现粉红色生长，划线初始浓度较高??细菌增长密集，如图３所示，培养基显示有单菌落的形态。菌落呈圆形，且有凸??起状，边缘较整齐。??图３显色培养基??Ｆｉｇ．３?Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ?ｍｅｄｉｕｍ??１．２哥伦比亚血琼脂平板上生长形态??如图４所示，金黄色葡萄球菌在哥伦比亚血琼脂平板上菌落呈白色，通过纯??化培养，菌落生长不密集，纯化后的单菌落较多，菌落周围出现溶血现象。如图??５所示，挑取密集菌落通过肉眼观察，可见金黄色。??＃?ＪＨ??图４血琼脂平板?图５肉眼可见金黄色??Ｆｉｇ．４?Ｂｌｏｏｄ?ａｇａｒ?ｐｌａｔｅ?Ｆｉｇ．５?Ｇｏｌｄｅｎ?ｙｅｌｌｏｗ?ｖｉｓｉｂｌｅ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｎａｋｅｄ?ｅｙｅ??１８??

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【参考文献】

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本文编号：2876137