鹿源牛病毒性腹泻病毒分离鉴定及cp型BVDV激活NF-κB分子机制研究

发布时间：2020-11-09 08:35

　　 牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的多临床表现的疾病。各个年龄的牛对该病均易感,其临床症状主要包括急性出血综合症、持续性感染、免疫抑制、免疫耐受、呼吸道和胃肠道疾病、生殖功能不全。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类传染病,在我国入境动物传染病名录将其列为二类传染病。BVD最早发现于美国纽约州,随后分离到病毒,此后世界各地陆续报告了该病的发生。我国学者李佑民于1983年自牛的流产胎儿脾脏分离并鉴定了BVDV,系我国对该病的首次报道。BVD在世界范围内呈地区性流行,畜牧业发达地区的动物感染率较高,成为危害养牛业的主要传染病之一,对世界的养殖业造成了巨大的经济损失。1.鹿源牛病毒性腹泻病毒分离鉴定及遗传变异分析对采自吉林省鹿的疑似腹泻样品进行处理后接种牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)对病毒进行分离,经系统的形态学、免疫学和分子生物学鉴定,确定为鹿源牛病毒性腹泻病毒,分别命名为:BVDV JL01、BVDV F3、BVDV Y3、BVDV de4和BVDV SY4。采用免疫过氧化物酶单层细胞实验对分离株进行进一步鉴定和TCID_(50)测定,结果表明:BVDV JL01、BVDV F3、BVDV Y3、BVDV de4、BVDV SY4的TCID_(50)分别为10~(5.3)TCID_(50)/mL、10~(5.8)TCID_(50)/mL、10~(4.7)TCID_(50)/mL、10~(5.5)TCID_(50)/mL和10~(4.4)TCID_(50)/mL。BVDV-JL01、BVDV-F3、BVDV-Y3、BVDV-de4为cpBVDV,BVDV-SY4为ncp BVDV。根据Genbank登录的BVDV不同毒株的参考序列设计引物扩增Npro和E2基因,使用DNAStar对分离株BVDV Npro和E_2基因与Genbank中登录的BVDV不同基因型进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析。结果表明:BVDV-JL01、BVDV-F3、BVDV-Y3、BVDV-de4为BVDV-1型,BVDV-SY4为BVDV-2型。对分离毒株E2蛋白的糖基化位点预测结果表明,BVDV-JL01株和BVDV-de4株均有9个潜在的N-糖基化位点,BVDV-Y3株和BVDV-SY4株均有10个潜在的N-糖基化位点,糖基化位点不一致。BVDV-F3株具有11个潜在的糖基化位点。2.牛病毒性腹泻病毒激活NF-κB分子机制研究通过双荧光素酶报告检测系统分析cp和ncp不同生物型BVDV感染对MDBK细胞中NF-κB的激活作用,结果表明cp型BVDV可显著激活与未感染组比较,cp型BVDV JL01株在感染48h可显著激活NF-κB,而ncp型BVDV SY4株感染未能激活NF-κB,且cp型BVDV对NF-κB的激活存在量效关系。激光共聚焦分析结果表明,与未感染对照组比较,随着感染时间的增加cp型BVDV感染显著激活了NF-κB的表达,在感染4h NF-κB p65表现为明显的核转位。ncp型BVDV感染未见p65核转位。表明cp型BVDV感染激活NF-κB表达,并引起核转位。通过Real-time PCR和Western blot分析TL3、TLR4、RIG-Ⅰ信号转导途径BVDV激活NF-κB的信号通路,为研究BVDV致病机制奠定基础。3.激活NF-κB信号通路牛病毒性腹泻病毒蛋白筛选为了鉴定BVDV编码的结构蛋白和非结构蛋白在激活NF-κB中的作用,构建BVDV各个基因的真核表达载体,将其与NF-κB报告质粒和海肾内参质粒共转染后通过双荧光报告系统进行分析,结果表明BVDV NS5B蛋白能显著激活NF-κB。4.牛病毒性腹泻病毒NS5B激活NF-κB分子机制研究为了探究BVDV NS5B对NF-κB的激活机制。将NS5B蛋白的真核表达质粒转染细胞,表明NS5B对NF-κB的激活存在量效关系,NS5B蛋白可诱导IκB降解,胞浆p65和胞核内p65蛋白的磷酸化。为了进一步明确NS5B蛋白激活NF-κB的功能域,基于NS5B蛋白结构域,将NS5B截短为6段进行分段表达,NS5B-NT、NS5B-Core、NS5B-finger、NS5B-palm、NS5B-thumb和NS5B-CT。双荧光素酶报告检测系统测定转染细胞中NF-κB和海肾荧光素酶活性,结果表明,BVDV NS5B蛋白、NS5B-Core、NS5B-finger和NS5B-palm均能激活NF-κB,空载体对照组相比差异极显著,说明激活NF-κB的区域位于NSB5蛋白的RdRp聚合酶催化活性中心。Real-time PCR检测转染NS5B截短突变体后IFN-Ⅰ的mRNA表达水平,结果表明,NS5B的截短突变体通过激活NF-κB信号通路诱导IFN-ⅠmRNA水平的升高。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

牛病毒性腹泻病毒基因组结构图

样受体 样受体组成和分布免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线。宿主的天然免疫系统通pattern recognition receptors，PRRs）病原相关分子模式（pathogen patterns，PAMPs）。Toll 样受体是可在近 20 多种细胞上表达的一类模 受体结构为Ⅰ型跨膜结构蛋白，由负责识别 PAMPs 的富含亮氨酸保守含 TIR 的胞内区和富含亮氨酸，决定 TLRs 亚细胞定位的跨膜区组成。氨酸重复基序（leucine-rich repeat，LRR）决定了其在细胞中的定位。鼠有 12 种 TLRs，牛有 10 种 TLRs：TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6面表达，识别细菌细胞壁成分和病毒颗粒；TLR3、TLR7、TLR8、TLR9细胞内的囊泡膜或细胞器膜上表达，识别细胞内相应的病毒核苷酸，参反应。TLR2 与 TLR1 或 TLR6 识别革兰氏阳性菌中的肽聚糖、脂蛋白-124]（图 1.2）。

.2.1 RIG-ⅠRIG-Ⅰ是一个双链 RNA 依赖的 ATPase。在未感染细胞中，RIG-Ⅰ呈自我反应构象，ARDs 难以参与信号转导。CTD 介导 RIG-Ⅰ解旋酶结构域与 RNA 的 5′三磷酸末端结合。毒 RNA 与 RIG-Ⅰ结合诱导构象发生变化 CARD 暴露出来与 E3 连接酶 TRIM25 依赖的泛素化 K63 的 L172 或内源性 K63 连接的聚泛素链结合[144-145]。多聚泛素化的 CARD 通 CARD 与 CARD 的互作招募适配器 MAVS[143,146]。激活后，MAVS 聚集在线粒体膜外，过系列适配器和激酶，激活转录因子 IRF3、IRF7、AP1 和 NF-κB 协同调控 IFN-I 基因表达[147]。若干额外的蛋白修饰酶和 RNA 结合增强子可调控。许多病毒形成了抵抗 RLH路的机制，包括新世界沙粒病毒 Z 蛋白对 RIG-I 的直接抑制作用，流感病毒 NS1 蛋白过 TRIM25 介导 RIG-I 的聚泛素化，HCV 蛋白通过裂解 MAVS 而灭活[148-150]。.2.2 MDA5MDA5 介导抗病毒感染的先天免疫反应。MDA5 可识别长度在 0.5~7kb 之间的细胞和图 1.3 RLR 受体示意图Fig.1.3 Schematic representation of RLR
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 杜锐,杜威,王树志;粘膜病病毒感染幼鹿的病原流行病学调查[J];吉林农业大学学报;2000年03期

2 王新平，宣华，朱维正，常国权，李佑民，王克坚，王晓伟;鹿感染牛病毒性腹泻－粘膜病病毒的调查[J];中国畜禽传染病;1995年04期

相关硕士学位论文 前1条

1 陈锐;中国西部四省区散养肉牛BVDV流行病学调查和一株分离毒株的全基因组测序[D];中国兽医药品监察所;2016年

本文编号：2876163