可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究

发布时间：2020-11-09 09:54

【摘要】：禽白血病病毒(Avian leucosis virus,ALV)、马立克病病毒(Marerk’s disease virus,MDV)、传染性法氏囊病病毒(Infectious butsal disease virus,IBDV)是引发家禽免疫抑制病的主要病毒性病原。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)是引发家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。由于传统的诊断检测方法难以进行多病原或多病原型的联合检测,使生产上发生的同类型疫病短时间内难以鉴别。考虑到家禽疫病防控急需,基于上述六种病原的高通量同步检测和部分病原同步分型检测方法尚未见报道。本研究结合金标银染显色技术,构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检可视化基因芯片,对芯片的制备及检测过程进行条件优化,并对临床初步应用进行评价。研究主要结果如下:一、ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建、检测条件优化和质量评价1.ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建与检测条件优化。以ALV、MDV、IBDV的全基因组为模板,克隆得到ALV-ENV、MDV-MEQ及IBDV-VP2基因序列,设计寡核苷酸探针,成功制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV共检基因芯片(简称共检芯片Ⅰ)。对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol/L,40℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的使用浓度为4μg/mL,染色时间为5min,对阳性标本最终银染显色可见明显检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。芯片检测特异性试验显示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应,特异性好,且以IBV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅰ杂交;敏感性试验显示,芯片的最低检测浓度是1pg/μl。稳定性试验发现,基因芯片能在常温条件下进行有效保存不少于60 d,4℃条件下保存不少于75 d。二、禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六种亚型联合共检可视化基因芯片的构建、检测条件优化和质量评价1.H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片构建与检测条件优化。以H5N6、H7N9和H9N2禽流感病毒毒株的全基因组,以及合成制备的H5N1毒株的NA保守序列片段,克隆得到H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA和N2-NA共6个靶基因,并成功制备出H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片(简称共检芯片Ⅱ);对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现使用浓度为50μmol/L的寡核苷酸探针与含有生物素标记的靶基因PCR产物45℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的最佳使用浓度为4μg/mL,银染7min,阳性标本银染显色可见明显的检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。基因芯片的特异性试验显示芯片特异性高,无交叉反应,且以ALV、MDV、IBDV、NDV、IBV、ILTV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅱ杂交;敏感性试验显示芯片的敏感性好,H5和N1亚型芯片的最低检测浓度是1×10~(-10)ng\ul,H7亚型芯片的最低检测浓度是1×10~(-8)ng\ul,N9亚型检测芯片的最低检测浓度是1×10~(-7)ng\ul,H9和N2亚型芯片的最低检测浓度是1×10~(-8)ng\ul,均不同程度的高于RT-PCR检测技术;稳定性试验显示,本研究建立的可视化芯片4℃条件下可保存不少于90d。三、共检芯片Ⅰ和共检芯片Ⅱ的初步临床应用将本研究构建的两套基因芯片对四川安岳、彭州、泸州、广元、自贡、乐山、广汉、温江、重庆、山东等地区疑似患禽白血病、马立克病、传染性法氏囊病、禽流感、新城疫和传染性喉气管炎的155份临床送检样品进行检测,其中,六类禽病毒病基因芯片的检测结果为ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV的阳性检出率分别为7%、1.2%、0.6%、5.8%、14.8%、0%,其中混合感染ALV和AIV为4.5%,NDV和AIV为2.5%,ALV、MDV和IBDV为0.6%,ALV、AIV和NDV为1.2%,该检测方法的敏感性略高于PCR/RT-PCR检测方法,二者方法的符合率高于98%;H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检芯片的检测结果为H5、H7、H9、N1、N9、N2的阳性检出率分别为4.3%、0%、43.4%、0%、34.7%、4.3%,其中H9N9亚型检出率为21.7%,H9N2亚型检出率为4.3%,H5和H9亚型共同感染检出率为4.3%,该检测方法与RT-PCR方法相比,敏感性为100%,特异性高于92.8%,符合率高于95.6%,对二者结果进行差方检验的Kappa值均0.80,表明两种检测方法具有很好的一致性。综上,本研究成功构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型同步共检基因芯片,两种基因芯片具备较好的特异性、灵敏性和稳定性,能有效应用于上述禽类疫病的临床样本检测,为此类禽疫病的快速鉴别诊检提供了新的先进手段。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.3
【图文】：

个为 NDV-F 基因，第四排前三个为 AIV-NP 基因, 第四排后三个为 ILTV-TK 基因，如图 2-1。图2-1 基因芯片矩阵设计图Fig. 2-1 The design of DNA microarray2.2.5.2 可视化基因芯片探针的稀释将点样缓冲液和 ddH2O 按 1:4 的比例混匀，用以稀释合成的寡核苷酸探针，调整其终浓度为 50μmol/L。吸取稀释的寡核苷酸探针混合液 80μL 轻轻加至 384 孔板相应的孔中，每个孔代表一种靶基因的探针稀释液，两种靶基因的孔之间间隔两个孔的位置，以免靶基因混合液之间污染（注意探针混合液在孔内不能有气泡）。将 384 孔板放于点样仪相应的位置上。同时，将醛基玻片置于点样仪的模块上，在点样之前，对点样仪进行一次校正。2.2.5.3 可视化基因芯片点样仪的校正打开电脑、点样仪电源，点样针装入点样仪相应的位置。电脑上打开晶芯 PersonalArrayer 16 操作软件，自检结束后进入设置界面，控制点样仪内环境湿度为 50 %以上，分别进行喷样准备、玻片设置、点阵设置、样品设置和清洗设置操作。在喷样准备中，分别校正清洗位置、抽干位置、第一片玻片位置、预喷位置、样品孔板 A24 孔位置、排空位置。玻片设置中 OX: 5.5mm

22图2-2 靶基因鉴定结果M：2000bp DNALadder； 1：λ 定位基因； 2：ALV-ENV；3：MDV-MEQ；4：IBDV-VP2；5：NDV-F；6：ILTV-TK；7：AIV-NP；N：阴性对照Fig. 2-2 The identification results of target geneM: 2000bp DNA Ladder; 1: λ; 2: ALV-ENV; 3: MDV-MEQ;4: IBDV-VP2; 5: NDV-F; 6: ILTV-TK; 7: AIV-NP; N: Negative control2.3.2 基因芯片制备的初检2.3.2.1 阳性定位基因的检测以 λ 定位基因为模板进行靶基因扩增标记，将 λDNA 扩增产物与含 6 种禽病毒病探针的芯片进行杂交，银染显色，肉眼观察试验结果。结果显示阳性质控 λ 定位基因杂交斑点明显可见，阴性对照和其它探针斑点没有可见杂交斑点（图 2-3）。表明本研究制备的醛基基片及阳性定位基因质量可靠。2.3.2.2 共检芯片全基因的检测6 种禽病毒病 6 个探针基因的全部探针位点均可以看到明显的杂交斑点，阳性对照斑点明显，阴性对照没有可见杂交斑点，表明制备的可视化共检芯片、选用探针基因质量可靠（图 2-4）。

.3.3.1 喷样次数优化结果结果显示，一次或两次喷样时，斑点信号差别不明显，但当第三次喷样时，探针出现位移导致杂交信号连在一起，影响最终杂交结果的判定。且随着喷样次数的增加验成本和时间增加。因此，选择一次喷样制备芯片（见图 2-5）。
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本文编号：2876245