基于血液组学解析荷斯坦奶牛乳蛋白产量的差异研究

发布时间：2020-11-10 02:44

　　 奶产量和乳蛋白率是评价奶牛泌乳性能的重要指标,直接关乎奶业利润,而乳蛋白产量(MPY)是反映二者的综合性指标。本研究从奶牛自身生理角度出发,以经产泌乳中期荷斯坦奶牛为研究对象,通过生理阶段、血液生化参数和血清激素分析,初步探究影响奶牛MPY的生理因素,进一步借助血液代谢组和全血转录组,从代谢-转录层面深入解析奶牛MPY差异的原因和调控机制,并挖掘出可反映奶牛MPY的潜在生物标志物,具有重要的实践意义。1 影响奶牛乳蛋白产量的生理因素初探在饲喂相同日粮和相同管理条件下,选取287头健康的泌乳中期荷斯坦奶牛,记录产奶量、分析乳成分,并抽取颈静脉血样分析血液生化参数和血清激素。首先依据胎次和泌乳天数(DIM)分组,分析奶牛不同生理阶段下泌乳性能、血液生化参数和血清激素水平;随后分析高、低MPY奶牛(HH、LL)的血液生化参数和血清激素差异,并结合全群关联分析,初步挖掘影响奶牛MPY的生理因素。1.1胎次和泌乳天数对奶牛泌乳性能、血液生化参数和血清激素的影响将奶牛按照胎次分为5组(胎次2-胎次6),按照DIM分为4组(DIM=90-119、120-149、150-179和180-219),分析比较不同胎次组或DIM组奶牛的泌乳性能指标、血液生化参数和血清激素水平,探究胎次和DIM对奶牛泌乳性能和上述血液指标的影响。结果发现,奶产量和乳蛋白率均受胎次和DIM的影响(P0.05),而MPY仅受胎次影响,其在胎次2-4组间保持稳定,并显著高于6胎组(P= 0.020)。与蛋白代谢、能量供应、肝肾功能和氧化应激有关的14个血液生化参数中,总蛋白、β-羟基丁酸和肌酐均受二者影响(P0.05);总胆固醇(P=0.001)和超氧化物歧化酶(P=0.034)仅受胎次影响;而血清尿素氮(P0.001)、血糖(P0.001)、非酯化脂肪酸(P0.001)、总胆红素(P0.001)、丙二醛(P0.001)、谷胱甘肽过氧化物酶(P= 0.038)和总抗氧化能力(P=0.001)仅受DIM影响。胎次对血清中所有的检测激素均无显著影响,而胰高血糖素(P=0.012)、IGF-1(P=0.001)和胰岛素敏感性指数(RQUICKI,P0.001)受DIM的影响,且DIM和胎次在胰高血糖素上存在交互作用(P=0.015)。1.2高低MPY奶牛的的血液生化参数和激素为了深入探究影响奶牛MPY的自身代谢因素,从上述287头试验牛中选取20头奶产量和乳蛋白率均高的个体(奶产量34.5 kg/d,乳蛋白率3.2%)作为高MPY组(HH:MPY1.11 kg/d),选取20头奶产量、乳蛋白率均低的个体(奶产量31.0 kg/d,乳蛋白率2.9%)作为低MPY组(LL:MPY0.87 kg/d);同时控制两组间胎次和DIM无显著差异,并将胎次和DIM作为固定效应引入统计模型,分析HH、、LL组奶牛的血液生化参数和血清激素差异,并结合全群关联分析,初步挖掘影响奶牛MPY的生理因素。研究发现仅总胆固醇和丙二醛在两组间存在显著差异,且HH组显著高于LL组(P0.05);HH组胰岛素有显著高于LL组的趋势(P=0.055)。全群关联分析显示总胆固醇(r= 0.341,P0.01)和超氧化物歧化酶(r=0.190,P0.05)与MPY显著正相关,而血糖(r=-0.141,P0.05)、丙二醛(r=-0.134,P0.05)和IGF-1(r=-0.189,P0.05)与MPY显著负相关。2基于血清代谢组探究奶牛乳蛋白产量的调控通路及代谢标志物将1.2部分的HH、LL牛作为本研究的试验牛,应用气相色谱-飞行时间检测器串联质谱(GC-TOF/MS)检测、鉴定血清中的代谢物,应用超高效液相色谱-质谱/质谱联用(UHPLC-MS/MS)定量关键差异代谢物。本试验共鉴定出178种代谢物质,其中差异代谢物36种(VIP1,P0.05),主要围绕缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成(P= 0.021,Impactvalue=0.333)和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(P=0.027,Impact value=0.243);生物标志物分析和定量结果显示,马尿酸、烟酰胺和壬酸三种物质可作为反映奶牛MPY的潜在生物标志物(AUC=0.943)。3基于全血转录组探究影响奶牛乳蛋白产量的转录调控机制从287头试验牛中选取12头奶牛,其中6头奶产量和乳蛋白率均最高的个体(奶产量36.0kg/d,乳蛋白率3.14%)作为高MPY组(HH:MPY1.14kg/d),6头奶产量和乳蛋白率均低的个体(奶产量33.0 kg/d,乳蛋白率2.95%)作为低MPY组(LL:MPY0.95kg/d),应用Novaseq 6000进行全血转录组学检测。本试验共鉴定出核心基因11003个,其中10257个为已知功能基因,其分子功能主要围绕结合(25%)和催化活性(25%),主要参与代谢进程(25%)和生物调控(20%)等生物学过程。共鉴定差异基因326个(DEGs:P0.05,FC1.5或FC-1.5),其中HH组上调基因225个,下调基因101个。DAVID功能注释分析显示DEGs主要围绕防御反应、免疫反应和炎症反应等(P0.001);独创通路分析(IPA)显示DEGs主要参与GP6信号、ILK信号和白细胞浸润等功能通路(P0.05,z-score≥1或z-score:≤-1)。选取两组间差异较大的7个基因进行qPCR验证,除H2AFY2表达量过低无法准确定量外,剩余6个DEGs均存在显著差异,且qPCR结果与RNA-seq的差异趋势一致。权重基因共表达网络分析(WGCNA)结果显示3个基因模块与MPY显著正相关(P0.05),同时与奶产量和乳蛋白率显著正相关(趋势);1个基因模块与MPY显著负相关(P0.05),同时与奶产量和乳蛋白率显著负相关(趋势);通过DAVID功能分析显示与MPY成正相关的基因模块主要参与信号调控、刺激反应及正调控蛋白代谢进程,而与MPY成负相关的基因模块则主要围绕代谢负调控和调节含氮物质代谢进程等功能。生物标志物和定量分析显示COL18A1可作为鉴定奶牛MPY的潜在生物标志物(AUC =1)综上所述,相同日粮和管理条件下,奶牛自身生理因素(生理阶段、血液生化、血清激素水平)初步反映了奶牛MPY的差异原因;结合血清代谢组学和转录组学深入挖掘造成奶牛MPY差异的通路及调控机制,为从生理角度研究如何提高奶牛MPY奠定了基础。本研究鉴定出可以反映奶牛MPY的生物标志物,具有重要的实践意义。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S823
【部分图文】：

提出了更高的要求。据２０１８年国民经济及社会发展统计公布，我国牛奶总产量为??３０７５万吨（国家统计局，２０１９）。联合国粮农组织公布的数据显示，２０１８年我国??牛奶总产量居于世界第六位（图１－１），位于印度、欧盟、美国、巴基斯坦和巴西??之后，相较于前几年排名有所降低，这主要与国内缩减了小型牛场数量，致使奶??牛存栏量降低，而与此同时印度和巴基斯坦的奶牛存栏数增加有关（联合国粮农??组织，２０１９）。同时，资料显示２０１８年美国奶牛单产超过１０．５吨（美国农业部，??２０１９），而我国２０１８年的奶牛单产为７．４吨（中华人民共和国农业农村部，２０１９），??仅为美国奶牛单产的７０％左右，因此国内奶牛单产仍然有有较大的提升空间。另??一方面，现行的生乳标准较低，将不利于指导、刺激奶业的优质高效发展，以ＭＰ??为例，国标规定生乳中ＭＰ含量为２．８％，而欧美国家多在３．２％以上，新西兰更是??高迖３．８％。综上

?１０??Ｌｏｇ２（ＦＣ）??图３－３?ＨＨ、ＬＬ奶牛血清代谢组火山图??Ｆｉｇｕｒｅ?３－３?Ｖｏｌｃａｎｏ?ｐｌｏｔ?ｏｆ?ｓｅｒｕｍ?ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ?ｆｏｒ?ＨＨ?ａｎｄ?ＬＬ??Ｔｈｅ?ｒｅｄ?ｏｒ?ｂｌｕｅ?ｄｏｔ?ｉｎｄｉｃａｔｅｓ?ａ?ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ?ｔｈａｔ?ｉｓ?ｍｏｒｅ?ａｂｕｎｄａｎｔ?ｉｎ?ｔｈｅ?ＨＨ??ｏｒ?ＬＬ?ｇｒｏｕｐ，?ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．?ＦＣ?＝?ｆｏｌｄ?ｃｈａｎｇｅ，?ｍｅａｎ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?ｐｅａｋ?ａｒｅａ?ｏｂｔａｉｎｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ＨＨ??ｇｒｏｕｐ／ｍｅａｎ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?ｐｅａｋ?ａｒｅａ?ｏｂｔａｉｎｅｄ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ＬＬ．?ＨＨ?＝?ｃｏｗｓ?ｗｉｔｈ?ｈｉｇｈｅｒ?ｍｉｌｋ?ｙｉｅｌｄ?（ＭＹ?＞??３４．５?ｋｇ／ｄ）?ａｎｄ?ｈｉｇｈｅｒ?ｍｉｌｋ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｏｎｔ

３．１?ｎｍｏｌ／Ｌ和６．１?ｎｍｏｌ／Ｌ，ＮＡＡ的方法最低检出限和方法最低定量哏值分别为??６．１ｎｍｏｌ／Ｌ和１２．２ｎｍｏｌ／Ｌ。ＨＵＡ和ＮＡＡ校准曲线的相关系数（Ｒ２）分别为０．９９９??和０．９９７?（图３－７），表明质谱反应和ＨＵＡ、ＮＡＡ的定量关系良好。??Ｈｉｐｐｕｒｉｃ?ａｃｉｄ??ＩＷ＊?？｛Ｓｌｌ＜ｎＭＦｉａｒｌ？０ＶＣＦ＞０００００ｆ＇０ｅ００ＣＯ＾？００（ｌ２３００００－＞Ｈ００００）Ｎ１７１？ｌｌ＜＾０１ｄ??ａ＊??Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ??ＩＭ＞?？ＥＳＪＭＲＭＦｒａ９－ｌ３〇（ＶＣＦ＞００００〇Ｆ＞〇ＯＯＯＣＩ〇ｅ｝０?０（ｉｎ〇０００?＞?８０００００）Ｋ１７ｔ？ｉｅ－Ｓ？ｉｖｌ＊；４８ｄ??Ｓａｍｐｌｅ?Ａ１３??Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ??ＩＩＯ?＞?？ＥＳＩ?ＭＲＭ?ｆ?ＷＣＴ?？０?０００?ＤＦ＊０?０００?ＯＤ〇１０?０?（ＩＳＯ?００００?＞?Ｉ０Ｓ?００００）?２０ｔ?０??ｌｉ－??１－??“?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ??１Ｍ?＜?＞ＥＳＩ?ＭＲＭ?Ｆ（ａ９＊ａ〇?９／Ｃｆ－Ｃ?０００?ＯＦ？０?０００?ＯＯｔｆｌＯ?０?（１Ｂ０?００００?■＞?Ｋｆｉ?００００）?？ｔ７１２ｌ？ＳａｎｖＨ?２－４０?ｄ??？??Ｉ??Ｓａｍｐｌｅ?Ａ１３??？７?＿４?Ｍ?０１?Ｉ?１７?Ｍ?１＞?Ｉ丨?７?９７?？＞?１?１２?１４?１（?３１?＜?４７?＜４?４１?？應?＆?＆丨?Ｍ?ｉ？＆雇（１７?Ｍ?ｆｌ?ｌ＞?７?７７?Ｍ?ｔ４?＞？
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

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本文编号：2877353