白介素-1β和胆固醇在猪瘟病毒感染中的作用

发布时间：2020-11-10 23:09

　　 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种具有高度传染性的病毒性疾病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病,我国将其列为一类动物疫病。CSFV对免疫系统的细胞有很强的亲和力,能够在巨噬细胞和树突状细胞中复制,并且引起细胞的一些抗病毒反应。病毒在它们生命周期的各个阶段都会与细胞膜上的脂质相互作用并调节脂质的代谢,这样能够帮助它们入侵、复制装配以及病毒的释放。本文主要围绕猪瘟病毒对IL-1β的释放以及胆固醇在猪瘟病毒感染中的作用展开了研究,获得了以下结果:(1)应用实时荧光定量PCR、ELISA等方法,证明猪瘟病毒感染能够诱导IL-1β的释放,Western blot检测发现猪瘟病毒感染后能够活化caspase-1,利用caspase-1的抑制剂证明猪瘟病毒是通过活化caspase-1来诱导IL-1β的释放。活性氧(ROS)在IL-1β的释放过程中起到了一定的作用,利用ROS探针发现猪瘟病毒感染能够上调巨噬细胞中ROS水平,并用ROS抑制剂PDTC证实了ROS并不参与猪瘟病毒诱导的IL-1β的释放。(2)提取CSFV感染的细胞总RNA,以反转录的c DNA为模板扩增得到CSFV p7基因的全长序列为210 bp,根据p EGFP-C3质粒图谱,成功构建了重组真核表达质粒p EGFP-p7并经过酶切和测序鉴定。将获得的阳性质粒通过转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)与猪巨噬细胞,G418(1500μg/m L)筛选等过程,经RT-PCR和Western blot鉴定后,成功得到了稳定表达CSFV p7蛋白的细胞株。后续的研究发现CSFV p7蛋白能够诱导IL-1β的释放,并且这种作用能够被离子通道抑制剂金刚烷胺所抑制。另外,利用蛋白酶体抑制剂MG132的作用,发现CSFV p7蛋白在不同的细胞系中都是一种不稳定的蛋白,会快速地通过蛋白酶体途径降解,而通过抑制降解发现,CSFV p7蛋白的增加会促进IL-1β的释放。研究结果为猪瘟病毒诱导的炎症反应机制提供了理论依据。(3)用胆固醇去除剂MβCD先孵育细胞1h来去除细胞膜上的胆固醇,然后感染猪瘟病毒,发现胆固醇的耗竭能够抑制猪瘟病毒入侵细胞,而且这种效果与MβCD剂量呈正相关。同样地,先用猪瘟病毒感染细胞,然后用MβCD去除细胞膜上胆固醇,发现胆固醇的耗竭同样能够抑制CSFV的复制增殖。为了验证MβCD对猪瘟病毒感染产生的影响是否为可逆的,进行了外源性胆固醇添加试验,发现添加外源性胆固醇能够部分中和MβCD处理对CSFV感染的影响。(4)将MβCD与猪瘟病毒混匀作用1h,用来去除猪瘟病毒囊膜上的胆固醇,为了排除药物的影响,将混合物稀释100倍后感染细胞。结果发现去除病毒囊膜上的胆固醇大大降低了猪瘟病毒的感染力。为了补充病毒囊膜上的胆固醇,添加了外源性的胆固醇到MβCD处理过的猪瘟病毒中作用1h,稀释100倍后再去感染细胞,发现添加了外源性胆固醇能够部分恢复猪瘟病毒的感染性。(5)通过实时荧光定量PCR和Western blot检测发现猪瘟病毒感染能够上调caveolin-1的表达。利用sh RNA,通过转染,嘌呤霉素的筛选(4μg/m L)以及鉴定,成功获得了一株能够干扰caveolin-1的细胞株。结果表明,干扰caveolin-1后,猪瘟病毒的复制增加了。说明caveolin-1介导的内吞作用在猪瘟病毒入侵细胞中并不起作用。综上所述,本研究通过试验发现CSFV能够通过激活caspase-1来诱导IL-1β的表达以及成熟,而ROS并不参与其中。进一步试验发现CSFV p7蛋白能诱导IL-1β的表达,而且这种作用能被离子通道抑制剂金刚烷胺抑制。研究结果为CSFV诱导的炎症反应机制提供了理论依据。此外,通过胆固醇去除试验发现细胞膜上胆固醇的耗竭不仅能够抑制CSFV的入侵,在CSFV的复制阶段也起了一定的作用,添加外源性的胆固醇能够部分中和这种效果。后续的试验发现CSFV感染能够上调caveolin-1的表达,干扰caveolin-1后CSFV的增殖会增加,证明CSFV入侵细胞并不是通过caveolin-1介导的内吞,这为阐明脂筏在CSFV生命周期中的作用提供了一定的理论依据。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S858.28
【文章目录】：
摘要
abstract
文献综述
    第一章 病原感染过程中炎性小体的活化和IL-1β 释放研究进展
        1.1 炎性小体及其功能
        1.2 抗病毒免疫反应中的IL-1β 和IL-18
        1.3 病毒感染中炎性小体的激活
            1.3.1 NLRP3 炎性小体
            1.3.2 AIM2 炎性小体
            1.3.3 IFI16 炎性小体
            1.3.4 RIG-I炎性小体
        1.4 炎性小体激活病毒性逃避和效应功能
        1.5 抑制炎性小体组装
            1.5.1 抑制caspase-1 功能
            1.5.2 IL-1β 和IL-18 的中和作用
        1.6 Viroporin激活炎性小体
        1.7 展望
    第二章 脂筏和胆固醇在病毒感染中的作用研究进展
        2.1 脂筏的功能及脂筏途径
            2.1.1 发动蛋白依赖的脂筏途径
            2.1.2 非发动蛋白依赖的脂筏途径
        2.2 脂筏在病毒感染中的作用
        2.3 脂筏作为病毒进入的平台
            2.3.1 非囊膜病毒
            2.3.2 囊膜病毒
        2.4 脂筏在病毒复制、装配和释放中的作用
            2.4.1 非囊膜病毒
            2.4.2 囊膜病毒
        2.5 展望
试验研究
    第三章 猪瘟病毒感染对IL-1β 释放的影响
        3.1 材料
            3.1.1 病毒，细胞与主要试剂
            3.1.2 主要溶液的配制
            3.1.3 主要仪器设备
        3.2 方法
            3.2.1 实时荧光定量PCR
            3.2.2 Western blot
            3.2.3 猪瘟病毒感染诱导IL-1β 释放的检测
            3.2.4 ROS是否参与猪瘟病毒感染诱导IL-1β 释放的检测
            3.2.5 猪瘟病毒感染激活caspase-1 的检测
        3.3 结果
            3.3.1 猪瘟病毒感染诱导IL-1β 释放
            3.3.2 猪瘟病毒感染诱导IL-1β 释放需要病毒的复制
            3.3.3 CSFV感染能够上调ROS水平
            3.3.4 ROS不参与CSFV诱导的IL-1β 释放
            3.3.5 CSFV感染激活caspase-1
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 猪瘟病毒p7 蛋白诱导IL-1β 释放的研究
        4.1 材料
        4.2 方法
            4.2.1 克隆CSFV p7 基因序列及分析
            4.2.2 真核表达载体pEGFP-p7 的构建
            4.2.3 pEGFP-p7 质粒的转染及稳转细胞系的建立
            4.2.4 稳转细胞株的鉴定
            4.2.5 CSFV p7 蛋白诱导IL-1β 释放的检测
            4.2.6 CSFV p7 蛋白降解特性的研究
            4.2.7 MG132 和amantadine对CSFV p7 诱导的IL-1β 释放的影响
        4.3 结果
            4.3.1 扩增CSFV p7 基因及序列分析
            4.3.2 真核表达载体pEGFP-p7 的构建
            4.3.3 稳定表答CSFV p7 蛋白的细胞株的建立及鉴定
            4.3.4 CSFV p7 蛋白诱导IL-1β 释放
            4.3.5 CSFV p7 蛋白是一种不稳定的蛋白
            4.3.6 MG132 和amantadine对CSFV p7 诱导的IL-1β 释放的影响
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 胆固醇在猪瘟病毒感染中的作用
        5.1 材料
        5.2 方法
            5.2.1 MTT法检测甲基-β-环糊精（MβCD）对巨噬细胞毒性
            5.2.2 细胞质膜及病毒囊膜上胆固醇的去除与补充
            5.2.3 去除细胞质膜上的胆固醇对CSFV入侵的影响
            5.2.4 不同浓度MβCD处理对CSFV入侵的影响
            5.2.5 细胞质膜上的胆固醇耗竭对CSFV入侵细胞后的影响
            5.2.6 病毒囊膜上胆固醇的耗竭对CSFV入侵细胞的影响
        5.3 结果
            5.3.1 MβCD细胞毒性的测定
            5.3.2 去除胆固醇影响CSFV的入侵
            5.3.3 胆固醇的耗竭影响CSFV的复制
            5.3.4 添加外源性胆固醇能够部分逆转MβCD处理对CSFV的影响
            5.3.5 病毒囊膜上的胆固醇影响CSFV感染
        5.4 讨论
        5.5 小结
    第六章 猪瘟病毒感染对caveolin-1 表达的影响
        6.1 材料
        6.2 方法
            6.2.1 caveolin-1 引物的设计
            6.2.2 CSFV感染后巨噬细胞 3D4/2 中caveolin-1 表达的检测
            6.2.3 确定嘌呤霉素筛选浓度
            6.2.4 caveolin-1 干扰细胞的筛选
            6.2.5 caveolin-1 干扰细胞干扰效果的检测
            6.2.6 干扰caveolin-1 后对CSFV感染的影响
        6.3 结果
            6.3.1 CSFV上调caveolin-1 的表达
            6.3.2 caveolin-1 干扰细胞的筛选
            6.3.3 caveolin-1 干扰细胞株的鉴定
            6.3.4 干扰caveolin-1 后对CSFV感染的影响
        6.4 讨论
        6.5 小结
结论
本论文的创新点
有待于进一步研究的问题
参考文献
主要缩略词和中英文对照表（Abbreviation Index）
致谢
作者简介

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 邱昌庆,周继章,高双娣,程淑敏;卫可和泛福露益消毒剂抗猪瘟病毒试验[J];中国兽医科技;2003年03期

2 宁宜宝,王琴,赵耘;猪瘟病毒持续感染与猪瘟预防控制[J];中国兽药杂志;2005年05期

3 曹晟,张楚瑜,伊光辉;猪瘟病毒的重组分析[J];遗传学报;2005年01期

4 杨克礼;徐涤平;梁望旺;刘泽文;汪宏才;段正赢;;猪瘟病毒检测技术研究进展[J];安徽农业科学;2007年16期

5 李学伍;张改平;郭启祥;;猪瘟病毒生物学特性研究概述[J];河南农业科学;2007年10期

6 魏淑英山东省潍坊市畜牧检测中心;张启迪;刘焕奇;王斌;潘宗海;;巢式PCR技术在猪瘟病毒检测中的应用[J];畜禽业;2008年05期

7 袁建琴;高斌战;梁新华;;猪瘟病毒基因表达谱芯片的可靠性研究[J];激光生物学报;2008年05期

8 袁雪梅;陈宁;陈宇;王萍;童超;李得江;万婧;李肖梁;方维焕;;两种荧光定量PCR方法检测猪瘟病毒的比较及应用[J];中国动物传染病学报;2010年03期

9 和彦良;李真光;冷雪;徐晓琴;武华;;猪瘟病毒感染后对机体免疫系统的影响[J];中国畜牧兽医;2011年12期

10 岳铃;蒋大良;聂福平;鲍晓伟;李乙江;王志慧;黄微;王意银;范泉水;肖啸;余兴龙;李作生;;猪瘟病毒单克隆抗体制备及病毒荧光检测研究[J];上海畜牧兽医通讯;2012年04期

相关博士学位论文 前10条

1 李河林;猪瘟病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及免疫保护试验[D];西北农林科技大学;2015年

2 童超;猪瘟病毒石门株和疫苗C株嵌合病毒构建及其特性鉴定[D];浙江大学;2015年

3 林鸷;白介素-1β和胆固醇在猪瘟病毒感染中的作用[D];西北农林科技大学;2015年

4 郭焕成;猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒寡核苷酸芯片的研究与应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

5 戚昀;猪瘟病毒表位疫苗的研究[D];清华大学;2009年

6 冯励;猪瘟病毒感染对宿主细胞免疫应答基因的影响[D];广西大学;2012年

7 王铁东;抗猪瘟病毒转基因猪的构建及初步研究[D];吉林大学;2009年

8 宁蓬勃;猪瘟病毒石门株与C株感染宿主细胞差异表达基因及其在病毒致病中的作用[D];西北农林科技大学;2013年

9 周斌;假型猪瘟病毒体系构建及衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究[D];南京农业大学;2010年

10 李江南;RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究[D];吉林大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 安丽菁;蛋白质二硫键异构酶（PDI）表达与猪瘟病毒感染相关性研究[D];西北农林科技大学;2015年

2 王向鹏;猪瘟病毒野毒胶体金免疫层析检测方法的建立[D];西北农林科技大学;2010年

3 朱蓓蓓;猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其初步应用[D];华中农业大学;2009年

4 洪海霞;猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及猪瘟病毒对其的致病变作用[D];西北农林科技大学;2004年

5 张韧;猪瘟病毒荧光抗体的制备及初步应用[D];华中农业大学;2013年

6 王海震;猪瘟血清抗体检测试剂盒的研制与抗猪瘟病毒基因工程疫苗的研究[D];南京农业大学;2005年

7 闫红岩;构建基因组分节段的猪瘟病毒石门株[D];山东师范大学;2013年

8 许保疆;稳定分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用[D];河南农业大学;2009年

9 朱妍;猪瘟病毒特异性单克隆抗体的研究[D];吉林农业大学;2005年

10 吴丹;猪α干扰素基因的克隆、表达及其抗猪瘟病毒活性的研究[D];中国农业大学;2003年

本文编号：2878434