猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备

发布时间：2020-11-11 06:44

　　 猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的以急性肺脏出血或慢性纤维素性胸膜粘连等为特征的一种呼吸道传染性疾病。Apx外毒素是APP最重要的致病因子,且有ApxI、ApxII、ApxⅢ和ApxⅣ4种毒素因子,其中ApxⅠ可引起疾病出现肺部典型病变,也是引起猪传染性胸膜肺炎的最强毒力因子,而ApxⅣ毒力相对较弱,但可由所有的APP分泌,且只有APP在动物体内时ApxⅣ才会被诱导表达,因此当ApxI、ApxⅣ两种毒素因子同时存在时,则会对猪传染性胸膜肺炎的诊断具有十分重要的临床价值。通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和ApxIVA基因组DNA,建立双重PCR方法检测并扩增ApxIA和ApxIVA基因片段,并采用TA克隆技术获得重组质粒,然后进行生物信息学分析目的基因片段特性并进筛选,再进一步的蛋白表达、纯化及多克隆抗体制备。试验结果如下:1、成功建立了毒素ApxIA和ApxⅣA基因双重PCR体系,ApxIA和ApxⅣA在DNA模板浓度为240μmol/L和150μmol/L、引物浓度为2ng/mL、Tm值55℃条件下可同时获得两条较亮目的条带,且特异性和稳定性检测效果极佳。2、成功获得了pMD18–ApxIA、pMD18–ApxIVA重组质粒,通过基因生物信息学分析筛选出了基因片段长度为1 209 bp的ApxIA和目的基因片段长度为972bp的ApxⅣA的两段蛋白表达强基因片段。与NCBI上的基因序列进行同源性比较发现相似度均有90%以上。3、获得高效价的ApxIA和ApxⅣA多克隆抗体,经ELISA检测的效价分别可高达1:200000和1:50000;在此效价经Western Blot检测为阳性。结论:成功建了ApxI A和ApxⅣA基因双重PCR方法,其特异性、稳定性较强;获得了ApxI A和ApxⅣA基因的多克隆抗体,效价分别可高达1:200000和1:50000,为今后猪传染性胸膜肺炎的诊断防控提供了参考。
【学位单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

3.1 单重 PCR 实验结果（1）引物浓度变化对结果的影响从引物灵敏性检测的结果（见图2-1）显示，ApxIA和ApxⅣA引物浓度在0.2ng/mL-2.0 ng/mL范围内都能检测到目的片段。但随着引物浓度增大，目的条带越明亮，检测结果越明显。引物浓度为2.0 ng/mL目的条带最为明显。图2-1 引物灵敏性检测.a：APXⅠA引物灵敏性检测; b：ApxⅣ A引物灵敏性检测; M：为DNA Maker 2000;1-10：引物浓度0.2ng/mL，0.4ng/mL，0.6ng/mL，0.8ng/mL，1.0ng/mL，1.2ng/mL

?pxIVA 基因双重 PCR 方法的建立及多克隆抗体的制备16图3 退火温度的影响. a：退火温度对APxⅠ A的影响; b：退火温度对ApxⅣ A的影响；M ：DNA Maker 2000；1-6：退火温度50℃-60℃Figure 2-3 Effect of Annealing Temperature.a:Effect of Annealing Temperature on APx I A;b:Effect of Annealing Temperature onApxⅣ A;M:DNA Maker 2000;1-6:Annealing Temperature 50℃-60℃3.2 双重PCR实验结果（1）引物浓度变化对结果的影响由图2-4可知，在双重PCR中，能扩增ApxIA基因的引物的最低浓度为0.4μmol/L。随引物浓度增加，目的片段的条带越明显。从图2-4可以观察到随着ApxⅣA引物浓度增大，虽然ApxⅣ A目的条带变得明亮，但ApxI A目的片段的条带却逐渐减弱直至消失。说明在双重PCR中，单个目的片段的扩增数量与引物的浓度并非简单的线性关系，还与另一引物的浓度有关。

第二章 试验研究17图2-4 双重PCR引物浓度变化对结果的影响.a：双重PCR中ApxI A引物浓度变化对结果的影响; b：双重PCR中ApxⅣA引物浓度变化对结果的影响；M：DNA Maker 2000; 1-10：ApxI A、ApxⅣA基因引物浓度0.2ng/mL，0.4ng/mL，0.6ng/mL，0.8ng/mL，1.0ng/mL，1.2ng/mL，1.4ng/mL，1.6ng/mL
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘岩;朱燕;林天宝;陈金娥;计东风;吕志强;;桑树APX基因的克隆及在拟南芥的遗传转化研究[J];浙江农业科学;2017年01期

2 高璇;刘进平;于莉;袁博轩;王旭初;张雪妍;;橡胶草APX基因家族的全基因组鉴定及表达分析[J];西北植物学报;2019年11期

3 孙晓东;李爱玲;韩立敏;;菘蓝APX基因克隆及序列分析[J];广西植物;2012年03期

4 赖玉兰;田明星;曹三杰;文心田;黄勇;;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5a型ApxⅣA全基因的序列测序及其分子特征[J];四川农业大学学报;2009年04期

5 李鹏;吴秀芬;马艳娇;阮楠;杨焕民;;猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因的克隆和表达[J];黑龙江畜牧兽医;2010年01期

6 袁秀芳;王一成;徐丽华;张存;叶伟成;;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APX Ⅱ基因特异片段的克隆和表达[J];浙江农业学报;2007年01期

7 贝为成,严琳,何启盖,肖少波,陈焕春;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗[J];农业生物技术学报;2005年05期

8 王超;杨传平;王玉成;;白桦抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因克隆及表达分析[J];东北林业大学学报;2009年03期

9 刘金林;贝为成;林荔雯;徐引弟;陈焕春;梅岭;;血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC~-/apxⅠA~+基因缺失重组菌株的构建与鉴定[J];微生物学报;2007年06期

10 赵卫平,逯忠新,陈振文,杨学山,赵萍,高鹏程,储岳峰;胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定[J];中国兽医科技;2004年05期

相关博士学位论文 前10条

1 王春来;胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构与功能分析及其突变体的研究[D];中国农业科学院;2004年

2 贝为成;猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究[D];华中农业大学;2005年

3 潘翔;毛白杨4CL基因启动子及APX的结构与功能研究[D];北京林业大学;2013年

4 师守国;苹果APX和GLDH转化兰州百合及兰州百合抗旱性研究[D];西北农林科技大学;2011年

5 程鸿;甜瓜APX和Mlo基因的克隆与功能分析[D];山东农业大学;2009年

6 孙云;茶叶抗坏血酸过氧化物酶（APX）的生理学与分子生物学研究[D];福建农林大学;2009年

7 刘慧春;红掌‘阿拉巴马’低温相关基因AOX、CAT和APX的表达分析、功能验证及遗传转化体系的构建[D];浙江大学;2012年

8 侯艳霞;草莓抗坏血酸代谢相关酶基因apx和dhar的克隆、序列分析及其表达模式研究[D];四川农业大学;2010年

9 陆燕元;干旱胁迫及复水过程中转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯生理生化响应机制研究[D];西北农林科技大学;2010年

10 王江英;山茶花APX、CPI、GA20ox1基因功能研究及木糖筛选体系建立[D];中国林业科学研究院;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 程素芳;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备[D];江西农业大学;2019年

2 李健华;猪胸膜肺炎放线杆菌检测及其ApxⅣ基因克隆与表达[D];贵州大学;2009年

3 张晓媛;农杆菌侵染法介导抗逆基因APX的旱稻转化[D];河北科技大学;2014年

4 马箐;过量表达毛白杨APX基因增强植物对非生物胁迫的抗性[D];山东师范大学;2012年

5 庞磊;茶树抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因克隆及逆境胁迫下的表达特性与生理响应[D];安徽农业大学;2012年

6 邵巍;龙眼胚性培养物胞质型apx基因克隆及其表达研究[D];福建农林大学;2008年

7 赵卫平;胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

8 李春宇;水稻APX基因的克隆及其对烟草的遗传转化研究[D];黑龙江大学;2009年

9 贺英;胸膜肺炎放线杆菌ApxⅢA基因的克隆表达及毒力因子免疫原性的测定[D];中国农业科学院;2007年

10 吴东;猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅱ抗原表位表达及间接ELISA方法建立与应用[D];安徽农业大学;2014年

本文编号：2878883