新霉素荧光偏振检测方法的建立及应用

发布时间：2020-11-11 08:21

　　 新霉素(Neomycin,NEO)属于氨基糖苷类药物。主要用来治疗畜禽耳炎、皮炎等感染,鸡白痢等疫病,还可以预防动物性疾病,并促进动物的生长发育,因价格低廉、效果明显而在畜牧业中得到了广泛应用。但长期使用,或超剂量用药,能在动物组织中沉积、残留,不仅会对动物健康造成危害,还会通过食物链危害消费者的健康。其危害性主要包括耳毒性、肾毒性以及神经肌肉阻滞现象等。新霉素残留现有的检测方法有微生物检测方法、色谱检测方法、免疫学检测方法等。在众多检测方法中,微生物法可通过半定量筛选实验对食物中的兽药残留进行分析,但无法定量;薄层色谱法可分离多种物质、成本低,但其结果易受主观因素影响;高效液相色谱能够为药代动力学研究和其它调查研究提供所需的检测特异性和灵敏度,但需要昂贵的仪器设备和熟练的操作人员;快速的酶联免疫在精确测定复杂体系中的新霉素的含量时非常有用,但操作过程中需要反复洗涤及孵育,影响了检测时间和效率。因此,构建新霉素简单、快速、特异的检测方法是一个热门研究方向。本论文拟通过新霉素人工抗原及单克隆抗体制备,结合荧光偏振技术,建立新霉素的荧光偏振免疫学检测方法。本文主要包含以下几个部分:1.新霉素人工抗原的合成与鉴定分析新霉素化学结构,针对新霉素化学结构中的氨基活性基团,选取牛血清蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)作为载体蛋白,采用戊二醛法制备人工免疫原NEO-BSA和NEO-OVA。通过紫外扫描、SDS-PAGE电泳进行初步鉴定,动物免疫对人工抗原进行进一步鉴定。紫外扫描结果显示,偶联产物与载体蛋白的吸收峰没有重叠;SDS-PAGE电泳结果显示,载体蛋白的迁移速率比偶联产物快,由两个实验初步判定人工抗原偶联成功;NEO-BSA所免疫小鼠的多抗血清效价都在1:6400以上,半数抑制浓度(IC50)为27.35ng/m L,表明偶联的人工抗原具有良好的免疫原性,且能诱导动物机体产生针对新霉素的特异性抗体。2.新霉素单克隆抗体的制备及鉴定取NEO-BSA免疫的小鼠中血清效价及灵敏度最高的小鼠的脾细胞,通过细胞融合技术将其与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用间接酶联免疫法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆等一系列筛选实验,筛选出3株能分泌抗新霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E9、4E8、1G1,经测定细胞上清效价均在1:6.4×103以上,选取效价较高的1E9杂交瘤细胞株用体内诱生腹水法制备腹水。将得到的单抗进行纯化,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定,判定纯化成功。通过间接竞争ELISA测抑制,得到线性回归方程为y=-0.7398x+2.813的标准曲线,相关系数R2=0.9948,根据线性回归方程可得IC50=1.338ng/m L。通过间接竞争ELISA对其特异性进行检测,与其它氨基糖苷类药物交叉反应率均低于0.01%,发现与其他药物均无交叉。经以上试验验证,成功制备了特异性高、灵敏度强的新霉素单克隆抗体,为荧光偏振检测方法提供了所需抗体。3.新霉素荧光偏振检测方法的建立将新霉素与荧光物质异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,获得示踪物,采用TLC进行分离纯化,分别经甲醇及碳酸盐缓冲液(CBS)萃取后,筛选出与抗体结合能力最佳的分离条带,即Rf=0.4由CBS萃取得到的物质。优化示踪物及抗体的工作浓度,对反应体系进行优化,建立标准曲线,得到线性回归方程Y=128.9+53.2/[(1+56.5/x)-1.175],由方程可得IC50为56.5ng/mL,线性范围为17.37ng/mL-183.92ng/mL,相关系数R2=0.9930。4.荧光偏振检测方法在检测牛奶中新霉素残留的应用对牛奶的处理方法进行优化,确定对牛奶先进行稀释,后采用饱和硫酸铵法沉淀处理牛奶。向牛奶中添加新霉素标品,配置成浓度为30ng/mL、50ng/mL、70ng/m L的新霉素牛奶溶液,对添加过标品的牛奶进行处理后,应用已建立的荧光偏振检测方法进行检测,回收率为87.91%-114.28%。
【学位单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S859.84;O657.3
【部分图文】：

图 1-1 荧光偏振检测原理图Fig. 1-1 The schematic diagram of FPIA.7 本研究的目的和意义随着研究的深入，人们逐渐认识到了氨基糖苷类抗生素的两面性，不合理会产生药物残留，进而对人类健康造成危害，所以应严格按照其限量进行，并注意休药期。然而现实生活中，在利益的驱使下，超限量使用的情况仍在，这就要求相关监管部门加大对抗生素类药物残留的监测力度。所以为了监管部门进对食品中新霉素残留进行快速精准监测，确保食品安全性，为广费者提供健康保障，建立完善的快速高效灵敏的新霉素的检测技术已刻不。在众多检测方法中，微生物法可通过半定量筛选实验对食物中的兽药残留分析，但无法定量；薄层色谱法可分离多种物质、成本低，但其结果易受主素影响；高效液相色谱在药代动力学研究和其它调查研究中提供所需要的特和灵敏度，但需要昂贵的仪器设备和熟练的操作人员；快速的酶联免疫在精

算其抑制率 B/B0（B0：新霉素浓度为 0 时的 OD450，B：新霉素其50），以 B/B0的结果为纵坐标，以新霉素质量浓度（ng/mL）的对，绘制新霉素对小鼠多抗血清的抑制曲线，根据绘制的标准曲线推，计算多抗血清对新霉素 50%的抑制浓度（IC50），以其来衡量多度。结果与分析新霉素人工抗原的鉴定结果1）紫外扫描鉴定结果用 U-3000 紫外扫描仪对 BSA、NEO-BSA、OVA、NEO-OVA 进 波长扫描。由图 2-1、图 2-2 可以看出 BSA、OVA 特征吸收峰在 物 NEO-BSA、NEO-OVA 在 268nm 处出现最大吸收峰，与 BSA 最移，初步证明偶联成功。

图 2-2 OVA、NEO-OVA 紫外扫描光谱Fig. 2-2 The UV scanning spectrum of OVA、NEO-OVASDS-PAGE 凝胶电泳鉴定 2-3 可知，NEO-BSA 的泳动速度小于 BSA，而且有较明显 BSA 的分子量小于 NEO-BSA，初步证明 NEO 与 BSA 偶联
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本文编号：2878965