创伤弧菌鞭毛蛋白、PCV2 Cap蛋白的融合表达及免疫应答研究

发布时间：2020-11-14 09:27

　　 猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒病(PCVD)的主要病原,引起猪的免疫抑制并能与其它病原微生物继发感染,给养猪业带来巨大的经济损失。Cap蛋白是其主要的开放阅读框ORF2编码的,是PCV2的免疫原性蛋白及主要的结构蛋白,在流行病学诊断及疫苗学研究中起着至关重要的作用。细菌鞭毛蛋白是TLR5的唯一配体,创伤弧菌鞭毛蛋白FlaB具有良好的分子佐剂作用。ELK16自聚肽融合标签能在菌体内形成类包涵体,其融合蛋白可用离心洗涤法纯化。本研究利用生物信息学软件,将FlaB、PCV2 Cap基因序列优化成大肠杆菌偏爱密码子序列,将合成序列克隆入自聚肽ELK16融合表达载体pET-ELK16,将重组载体 pELK16-FlaB-Cap、pELK16-FlaB 和 pELK16-Cap 转化 BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示,三种融合蛋白均以类包涵体表达,经0.5%Triton X-100离心洗涤后,ELK16-FlaB-Cap融合蛋白的纯度达90%,产量达92mg/L;ELK16-FlaB融合蛋白的纯度达96%,产量达105mg/L;ELK16-Cap融合蛋白的纯度达93%,产量达92mg/L。分别用ELK16-Cap + IFA(弗氏不完全佐剂)、ELK16-Cap + ELK16-FlaB 和 ELK16-FlaB-Cap 免疫小鼠,初免后 7、14、21 和 28 天采血,用间接ELISA进行抗体检测,结果显示初免后7天,三个免疫组即为ELISA抗体检测阳性,随后抗体水平呈逐渐上升趋势,其中ELK16-Cap+ELK16-FlaB免疫组的抗体水平最高,IFA + ELK16-Cap免疫组次之,ELK16-FlaB-Cap免疫组抗体水平最低。二免后14天取小鼠脾脏淋巴细胞,分别用ConA(5μg/mL)和Cap(10μg/mL)刺激,用试剂盒检测细胞因子表达。结果与对照组相比,免疫组的TNF-α、IL-12和IFN-y表达水平明显上升,其中Cap刺激组TNF-α显著高于ConA刺激组,两组IL-12和IFN-y水平相当。这些研究结果表明,ELK16-FlaB对PCV2 Cap蛋白ELISA抗体产生的具有刺激作用显,ELK16-FlaB-Cap的刺激作用相对较弱;ELK16-FlaB-Cap对刺激IL-12产生的作用较强,ELK16-FlaB对刺激TNF-α和IFN-y产生的作用较强。为了优化PCV2重组亚单位疫苗和比较纯化标签对FlaB免疫刺激作用的影响,将PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e中和抗原表位与PCV-2bCap基因串联,与His标签融合表达,并将His标签与FlaB基因进行表达融合,利用亲和层析纯化融合蛋白。再将FlaB基因与ELP(类弹性蛋白多肽)进行融合表达,利用相变循环纯化重组蛋白。将36只小鼠分为6组,分别为 PBS 对照组、His-4Cap 免疫组、His-4Cap + ELP-FlaB 免疫组、His-4Cap + His-FlaB免疫组、His-4Cap + ELK16-FlaB免疫组和His-4Cap + IFA免疫组。初免后7、14、21和28天采血,用间接ELISA测定Cap蛋白特异抗体;二免后14天取小鼠脾脏淋巴细胞,用ConA或His-4Cap刺激后检测细胞因子表达。二免后14天,每组3只小鼠用103个TCID50 PCV2攻毒,攻毒后3天和7天取小鼠血清进行病毒血症检测。结果在初免后第7天,His-4Cap + ELP-FlaB即为ELISA抗体检测阳性,其他四组为抗体检测阴性;从初免后14天,抗体水平呈上升趋势;在初免后21天,4个免疫组的抗体水平明显上升,其中His-4Cap+ His-FlaB免疫组的抗体水平最高。与对照组相比,五个免疫组的TNF-α、IL-12和IFN-y表达水平明显上升,His-4Cap刺激组的TNF-α水平高于ConA刺激组IL-12和IFN-y水平相当。这些研究结果表明,His、ELP和ELK16标签对FlaB刺激PCV2重组Cap蛋白ELISA抗体产生无明显影响,三种标签融合表达的FlaB均能刺激小鼠产生TNF-α、IL-12和IFN-γ表达,其中ELK16-FlaB的刺激作用较强。5个免疫组的小鼠血清病毒载量均下降,His-4Cap+ELP-FlaB免疫组的病毒载量最低。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

图１－丨融合表迗载体的结构示意图??Ｆｉｇｌ－１?：?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｆｕｓｉｏｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??１．５．１基因合成??用网上在线软件ＪＡＶＡＣｏｄｏｎＡｄａｐｔｉｏｎＴｏｏｌ，将ＦｌａＢ和Ｃａｐ编码序列（Ｋ１２株）偏爱密码子序列，序列在南京金斯瑞生物公司合成，克隆在ｐＵＣ１．５．２质粒提取??将ｐＵＣ５７－ＦｌａＢ和ｐＵＣ５７－Ｃａｐ重组菌按１：１００比例接种含１００Ｕ／ｍＬ氨液体培养基？，将ＰＥＬＫ１６菌株按１：１００比例接种含ＳＯｐｇ／ｍＬ卡那霉素的ＬＢ液培养过夜，分别收集菌体提取质粒，方法如下：??取５ｍＬ培养过夜的菌液，１２０００ｇ离心ｌｍｉｎ，弃上清，收集菌体；加Ｓ１?（含ＲＮａｓｅ?Ａ）重悬细菌沉淀，重悬均匀；加入２５０?ｐＬ?Ｂｕｆｆｅｒ?Ｓ２，上下体充分裂解，应在５ｍｉｎ内完成；加入３５０?｜ｉＬ?Ｂｕｆｆｅｒ?Ｓ３，上下翻转混合６？８

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?分析，结果显示：ＩＰＴＧ?诱导的?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ、ｐＥＬＫ１６－Ｃａｐ?和?ｐＥＬＫ１６－ＦＩａＢ－Ｃａｐ??重组菌分别出现预期的６５ＫＤａ、４７ＫＤａ和８２ＫＤａ额外蛋白条带，表达产物以类包涵体存??在于裂解菌体的沉淀中（图１－３、图１－４和图１－５）。??

Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?ｌ：ＥＬＫ１６－ＦｌａＢ；?２：ＥＬＫ１６－Ｃａｐ；??３：ＥＬＫ１６ＦｌａＢ－Ｃａｐ??图１－２表达载体的酶切鉴定??Ｆｉｇ．?１－２?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｕｓｉｏｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒｓ??２．２融合蛋白表达分析??２．２．１?３７°Ｃ诱导表达??将?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ、ｐＥＬＫ１６－Ｃａｐ?和?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ－Ｃａｐ?重组菌用?０．２?ｍＭ?ＩＰＴＧ?在?３７°Ｃ诱??导表达６ｈ后，离心收集沉淀菌体，经超声波裂解后离心，分别取离心上清和沉淀进行??ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?分析，结果显示：ＩＰＴＧ?诱导的?ｐＥＬＫ１６－ＦｌａＢ、ｐＥＬＫ１６－Ｃａｐ?和?ｐＥＬＫ１６－ＦＩａＢ－Ｃａｐ??重组菌分别出现预期的６５ＫＤａ、４７ＫＤａ和８２ＫＤａ额外蛋白条带，表达产物以类包涵体存??在于裂解菌体的沉淀中（图１－３、图１－４和图１－５）。??
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本文编号：2883319