猪德尔塔冠状病毒受体的筛选与鉴定

发布时间：2020-11-15 11:30

　　 δ-冠状病毒(Deltacoronavirus,DCoV)是冠状病毒科的新成员,能够感染哺乳动物和禽类。2012年中国香港首次报道了猪δ-冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV),它能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,严重危害养猪业的健康发展。到目前为止,PDCoV感染宿主细胞的过程尚不清楚,病毒粒子与其特异性受体结合是感染发生的首要条件,因此鉴定出PDCoV的受体,有望从分子水平上阐明PDCoV入侵宿主细胞中分子机制,为新型疫苗研制提供理论支持,同时也为德尔塔冠状病毒的受体研究奠定了基础。不同种属间冠状病毒受体差异较大,本研究根据已有的研究基础,经过合理的推断,以已知的猪冠状病毒受体猪氨基肽酶N(pAPN)和唾液酸分子(Sialic acid)为研究对象,通过对PDCoV非易感细胞乳鼠肾细胞(BHK-21)过表达,及易感细胞猪睾丸细胞(ST)过表达和RNA干扰试验(siRNA),细胞受体阻断试验等进行验证。结果表明pAPN和Sialic acid分子对PDCoV在易感细胞ST中复制并无影响,其不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,这为PDCoV致病分子机理的研究带来了新的参考依据。相关研究表明冠状病毒识别相应的受体并成功进入到宿主细胞,是由纤突(Spike,S)蛋白完成的。S蛋白是一种大的I型跨膜糖蛋白,按其功能不同,又将其分为位于N端的S1和位于C端的S2,而S1主要介导病毒与受体分子的结合。PDCoV能感染ST细胞,且能在ST细胞上繁殖,说明ST细胞表面存在PDCo V的受体分子。为进一步筛选鉴定PDCoV的受体,在此理论基础,本研究建立了PDCo V-S1蛋白真核表达纯化系统,使表达的PDCoV-S1蛋白接近天然蛋白的复杂构象,用免疫沉淀法(IP)法钓出ST细胞中与S蛋白相互作用的蛋白,经质谱鉴定筛选到了可能的受体分子,通过对其基因沉默、过表达,我们发现宿主蛋白热休克蛋白90AB1(p HSPCB)在PDCoV感染中起重要作用,结果表明pHSPCB上调表达促进PDCoV复制,p HSPCB被小分子干扰RNA敲低则抑制PDCoV复制,该蛋白有利于PDCoV在易感细胞ST细胞中增殖。本研究揭示了pAPN和Sialic acid不是PDCo V的受体分子,而热休克蛋白90AB1(p HSPCB)能促进PDCoV感染猪睾丸细胞,本研究结果为PDCoV侵入机制提供了新的参考依据。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

冠状病毒（Coronaviruses, CoVs）属于尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronavirinae）该病毒的宿主范围广，包括人、禽类及其他哺乳动物 (Jonassen et al., 2016; Liu et al., 2005; Van dehoek et al., 2004; Woo et al., 2009)。其中，δ-冠状病毒（Delatcoronavirus, DCoV）是2011年国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）新分出的冠状病毒属δ-冠状病毒最早于2007年，从中国白鼬獾和亚洲豹猫中检测得到 (Dong et al., 2007; Woo et al.2012)。而猪δ-冠状病毒（Porcine delatcoronavirus, PDCoV）是2012年新发现的一种猪冠状病毒，现已证实PDCoV具有较强的致病性，能导致母猪、仔猪发生水样腹泻、呕吐等，哺乳仔猪感染后死亡率可达30%~40% (Wang et al., 2014)，对我国养猪业造成了严重的经济损失。DCoV不仅感染哺育动物，还感染野禽，对公共安全具有潜在的威胁性，到目前为止DCoV感染宿主细胞的过程尚不清楚。1.1.1 PDCoV 分类地位PDCoV属于尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科（Coronavirus）、δ-冠状病毒属（Deltacoronavirus）的成员，如图1.1所示。

图1.2 PDCoV粒子结构和形态Fig. 1.2 The Architecture and morphology of PDCoV virionA：冠状病毒粒子结构；B：PDCoV粒子形态（PDCoV NH株，负染染色）rchitecture of coronavirus particles (Sandrineet et al., 2012); B: The morphology of PDCoV virion (NHCoV 基因组结构oV基因组长度是所有冠状病毒家族中最小的，约为25 kb (方谱县等，2016)，其基到3′端依次为：5′非编码区（UTR）、开放阅读框1a/1b（ORF1a/1b）、S基因、非结构蛋白6（nsp6）、N基因、非结构蛋白7（nsp7）和3′UTR，如图1.3所示 (′端2/3的基因组，编码两个较大重叠的开放阅读框ORF1a和ORF1b，其编码两个pp1ab。根据对其他冠状病毒的研究，PDCoV的多聚蛋白pp1a和pp1ab通常被病毒割、加工形成16个成熟的非结构蛋白，其主要与病毒复制转录有关 (Hurst et al., 2后1/3编码四个结构蛋白，依次是纤突蛋白（Spike, S）、小膜蛋白（Small memberaMemberane, M）以及核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N），以及辅助蛋白（Accessory pNS7，预计NS6位于在基因组中的M和N之间，而NS7则位于N基因内的一个ORF广泛分布于冠状病毒基因组中 (Riffault et al., 1997; Surjit et al., 2006; Woo et al

易感细胞表面的特异性受体结合完成的 (Brierley et al., 1989)。研究表明，病毒受体大多属于蛋白质，也有脂类或糖脂 (Adriaan, 2017)。冠状病毒感染宿主细胞的过程，以SARS冠状病毒为例，如图1.4所示 (Adriaan, 2017)。冠状病毒复制周期是从翻译病毒基因组的5'端ORF开始（ORF1a和ORF1b），其合成两个多聚蛋白pp1a和pp1ab，通过两个或三个ORF1a编码的蛋白酶的切割，蛋白水解后，从pp1a和pp1ab释放15或16个复制酶蛋白 (Brierley and Dos Ramos, 2006)。在复制酶的作用下，病毒基因组通过不连续转录模式，转录生成新的基因组RNA和亚基因组mRNA，接着进入细胞质，开始翻译过程：基因组RNA首先开始翻译，产生病毒RNA复制所需的蛋白酶；其次是亚基因组翻译
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本文编号：2884712