宁夏某牛场轮状病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

发布时间：2020-11-15 13:54

　　 牛轮状病毒感染(Bovine rotavirus,BRV)又称犊牛腹泻病毒(Calf diarrhea virus),由轮状病毒(Rotavirus,RV)引起的,RV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。轮状病毒是引起全世界幼儿和幼龄动物腹泻的主要原因。在养牛业,主要引起牛群腹泻、精神沉郁、厌食、脱水,甚至引起酸中毒死亡;牛轮状病毒病的感染多发生在1月龄以内的犊牛,其中7日龄以内的犊牛最易感染,通常在12~24 h即可引起犊牛严重腹泻,发病率为90%~100%,病死率最高可达50%。不仅能使奶牛产奶量下降而且会严重地影响病愈犊牛的生长发育;在成年牛中RV多呈隐性感染并在一定的时间排毒,造成持续感染。更重要的是患牛易继发细菌感染或与其他病毒混合感染,导致病情恶化,死亡率升高。RV是11个基因片段组成的双链RNA(dsRNA)病毒,它易通过点突变发生抗原变异、抗原漂移,产生新毒株,甚至造成种间传播,扩大感染宿主,危害更多的哺乳动物和禽类。为了对宁夏回族自治区患有消化道系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,本研究主要通过RT-PCR、PCR方法,对2017年来自宁夏某牛场腹泻牛的粪便进行RV检测。将阳性样品在MA-104细胞上进行病毒分离,病毒在细胞上盲传3代后出现细胞病变,直至第5代细胞病变明显,收获病毒培养物。成功分离到1株牛轮状病毒,并将其命名为NX23。根据RVA设计11个基因片段的扩增引物,对NX23进行全基因组扩增,将扩增产物回收纯化后连接在pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行亚克隆,将阳性的克隆菌进行序列测定。获得该分离株完整的编码区核苷酸序列,长度为17 427 bp,并利用RotaC~(2.0)、DNA Star与GenBank上的RV序列进行进化树、同源性分析。本研究对腹泻样品中的BRV进行分离鉴定,对NX23的全基因组编码区核苷酸序列进行分析。利用A群轮状病毒自动分型工具RotaC~(2.0),确定该毒株的VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5的基因型分别是:G8-P[1]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2。将NX23的11个基因片段与GenBank上检索到的不同血清群、不同基因型的RV序列进行分析。NX23的VP7基因片段与G8型的人、牛、猴、猪、羊、羊驼分离株形成一个小分支,而与人分离株MUL-13-204的VP7片段在进化树上最为接近。NX23的VP4基因片段与P[1]型人、牛、羊、羊驼、猴分离株形成一个小分支,而与牛分离株O Agent的VP4片段在进化树上最为接近。NX23的VP6基因片段与I2型人、牛、羊、羊驼、角鹿、羚羊、骆驼、兔分离株形成一个小分支,而与人分离株RV176的VP6片段在进化树上最为接近。NX23的VP1基因片段与R2型人、牛、羊、羊驼、角鹿、羚羊、猫、猴分离株形成一个小分支,而与人分离株1473的VP1片段在进化树上最为接近。NX23的VP2基因片段与C2型人、牛、羊、羊驼、角鹿、犬、猫、兔、骆驼分离株形成一个小分支,而与人分离株MUL-13-204的VP2片段在进化树上最为接近。NX23的VP3基因片段与M2型人、牛、羊、羊驼、角鹿、猪、猫、骆驼分离株形成一个小分支,而与骆驼分离株MRC-DPRU447的VP3片段在进化树上最为接近。分离株NX23的NSP1基因片段与A2型人分离株形成一个小分支,与人分离株MUL-13-204的NSP1片段在进化树上最为接近。NX23的NSP2基因片段与N2型人、牛、羊、蝙蝠、角鹿、羚羊、犬、猫、兔、猴、骆驼分离株形成一个小分支,而与人分离株RV176的NSP2片段在进化树上最为接近。NX23的NSP3基因片段与T2型人分离株形成一个小分支,与人分离株MUL-13-204的NSP3片段在进化树上最为接近。NX23的NSP4基因片段与E2型人、牛、羊、蝙蝠、角鹿、羚羊、马、猫、兔、猴、骆驼、疫苗分离株形成一个小分支,而与人分离株DRC86的NSP4片段在进化树上最为接近。NX23的NSP5基因片段与H2型人分离株形成一个小分支,与人分离株DS-1的NSP5片段在进化树上最为接近。根据进化树分析,推测牛分离株NX23可能为多物种来源的RV重配产物。本研究分析分离株NX23基因组遗传变异特点为研究BRV遗传变异规律提供参考。对防范牛源人兽共患病、轮状病毒的流行病学研究和基础研究层面具有多重意义。掌握BRV流行毒株的变异规律不但有利于BRV的防控,而且为评估疫苗免疫保护效力及新疫苗的研发具有指导意义。
【学位单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

BRVPCR鉴定250100188bp

图 3-2 MA-104 细胞的病变A：病变细胞；B：正常细胞Fig. 3-2 Cytopathic effect of MA-104 cellsA: Infected cell; B: Mock-infected cell
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本文编号：2884829