猪胞内劳森氏菌LAMP、PCR快速检测方法的建立及应用

发布时间：2020-11-16 12:11

　　 猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于猪感染胞内劳森氏菌引起的一种传染性肠道出血性的消耗性疾病,1931年Bieste和Sohwarce首次报道了该病,1974年Rowland等证实了该病,该病现已成为世界上流行最广的猪病之一。虽然,猪增生性肠炎引l起的死亡率不高,但由于其主要发病为慢性型,使得患病猪生长缓慢,饲料利用率和平均日增重明显下降,淘汰率上升,导致猪场经济损失严重。一些养猪业发达的国家和地区,由于饲料中抗生素的禁用或限用,导致猪增生性肠炎发病率逐年上升。在我国,临床猪增生性肠炎疑似病例有逐渐增多的趋势,但我国对猪增生性肠炎的研究还处于起步阶段,缺乏对该病的流行病学调查,因此开发快速准确的临床检测方法对于该病的研究具有重要的意义。本试验根据引物设计原理,针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列分别设计了PCR和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)特异性引物,通过对PCR方法退火温度的优化,LAMP方法的反应温度、反应时间、内外引物比例、dNTP浓度、镁离子浓度、甜菜碱的优化,确定其最优反应条件后成功建立了胞内劳森氏菌的PCR和LAMP两种检测方法。灵敏度实验结果表明建立的PCR方法可检出的拷贝数为103个,LAMP方法可检出的拷贝数为10’个；特异性试验表明,PCR方法和LAMP方法对E.coli、Salmonella、PEDV、PRV扩增结果均为阴性,且这两种方法稳定性和重复性良好。LAMP反应产物还可进行可视化检测,阳性反应产物在自然光下出现明显浑浊,加入SYBR Green Ⅰ染料后,在紫外灯照下,阳性反应管发出绿色荧光,而阴性反应管无荧光现象出现。应用本试验建立的PCR和LAMP两种方法检测从四川部分规模化养猪场采集的114份粪便样本,其中60份样本(52.6%)利用PCR和LAMP检测方法均检出为阳性,13份样本(11.4%)利用LAMP检测方法检出为阳性,PCR检测方法检出为阴性,41份样本(36.0%)利用PCR和LAMP检测方法均检出为阴性。应用FIRSTtest试剂盒进行复核检测,PCR检测方法的符合率为76.0%,LAMP检测方法的符合率为92.4%,LAMP检测方法具有更高的灵敏度。胞内劳森氏菌引起的猪增生性肠炎造成的死亡率不高,但是对猪场的经济造成较大的损失,且该病目前在我国感染率较高。本试验所建立的PCR和LAMP两种方法具有快速简便的特点,且LAMP方法不需要复杂的仪器设备,反应条件简便,成本较低,适用于实验室和现场快速检测。本试验建立的PCR和LAMP方法为胞内劳森氏菌的检测提供了一定的参考。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.61
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略词表（Abbreviations）
第一章 文献综述
    1 猪增生性肠炎概述
        1.1 病原学及其研究进展
            1.1.1 病原的分类及其结构特征
            1.1.2 致病机理
        1.2 流行病学及其研究进展
            1.2.1 易感动物和传染源
            1.2.2 地理分布及传播途径
        1.3 临床症状及病理变化
        1.4 诊断方法
            1.4.1 组织病理学诊断
            1.4.2 血清学诊断法
            1.4.3 分子生物学诊断
            1.4.4 FIRSTtest试剂盒诊断
        1.5 防治措施
    2 环介导等温扩增技术
        2.1 技术特点
        2.2 技术原理
        2.3 引物设计原则
        2.4 LAMP反应体系
    3 研究目的与意义
第二章 胞内劳森氏菌检测方法的建立
    1 实验材料
        1.1 实验材料
        1.2 主要仪器
        1.3 实验试剂
        1.4 相关试剂配制
    2 质粒模版的制备
        2.1 胞内劳森氏菌质粒的制备
        2.2 胞内劳森氏菌质粒浓度测定
        2.3 粪便样品DNA的制备
        2.4 其他细菌及病毒DNA或RNA的制备
    3 胞内劳森氏菌检测方法的建立
        3.1 引物的设计与合成
        3.2 引物的验证
            3.2.1 LAMP引物的验证
            3.2.2 LAMP结果判定
            3.2.3 PCR引物的验证
            3.2.4 PCR结果判定
        3.3 PCR产物克隆测序鉴定
            3.3.1 PCR扩增片段的胶回收
            3.3.2 重组质粒的连接
2法）及重组质粒的转化'>            3.3.3 感受态细胞的制备（CaCl₂法）及重组质粒的转化
            3.3.4 重组质粒的鉴定
            3.3.5 测序鉴定
        3.4 LAMP反应条件的优化
            3.4.1 反应温度的优化
            3.4.2 反应时间的优化
            3.4.3 内外引物比例的优化
            3.4.4 dNTP浓度的优化
            3.4.5 镁离子浓度的优化
            3.4.6 甜菜碱的作用
        3.5 PCR检测方法条件的优化
        3.6 灵敏度试验
        3.7 特异性试验
        3.8 稳定性试验
        3.9 临床应用试验
            3.9.1 临床样本的采集
            3.9.2 临床样本的检测
            3.9.3 临床样本的复核检测
    4 结果与分析
        4.1 质粒模版测序以及浓度的测定
        4.2 引物验证结果
        4.3 LAMP反应条件的优化
            4.3.1 反应温度的优化
            4.3.2 反应时间的优化
            4.3.3 内外引物浓度比例的优化
            4.3.4 dNTP浓度的优化
            4.3.5 镁离子浓度的优化
            4.3.6 甜菜碱的作用
        4.4 LAMP反应条件的确立
        4.5 胞内劳森氏菌LAMP可视化检测
        4.6 PCR反应条件的优化及条件的确立
        4.7 灵敏性试验
        4.8 特异性试验
        4.9 稳定性试验
        4.10 临床样本检测
TM试剂盒检测'>        4.11 FISRTtest^TM试剂盒检测
    5 讨论
        5.1 胞内劳森氏菌质粒模版的制备
        5.2 建立方法的分析
        5.3 反应条件对LAMP的影响
            5.3.1 反应温度对LAMP反应的影响
            5.3.2 内外引物比例对LAMP反应的影响
            5.3.3 镁离子浓度对LAMP反应的影响
            5.3.4 反应时间对LAMP反应的影响
            5.3.5 其他条件对LAMP反应的影响
        5.4 假阳性分析及应对措施
        5.5 临床样本分析
第三章 实验创新点及结论
    1 实验创新点
    2 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 郑新添;杨小燕;陈杰;戴爱玲;陈星星;李晓华;;猪增生性肠炎的PCR诊断[J];黑龙江畜牧兽医;2010年01期

2 兰家暖;肖爱欢;谢丽华;侯韶毅;陈云霞;黄伟坚;;广西猪增生性肠炎的PCR诊断[J];中国兽医杂志;2009年11期

3 周斌华,张廷青;应用PCR检测猪增生性肠炎[J];中国畜禽传染病;1996年04期

4 郭建超;覃宗华;张岩毅;蒲文珺;任邵娜;张浩吉;马春全;李国清;白挨泉;;猪增生性肠炎PCR诊断方法的建立及临床样品检测[J];动物医学进展;2014年04期

5 屈小轶;王扬伟;乔宏兴;蒋增海;徐耀辉;;某规模化猪场猪增生性肠炎的诊断与防治[J];中国猪业;2018年10期

6 郭业;;猪增生性肠炎治疗方法[J];农家之友;2016年01期

7 高峰;李雨来;;猪增生性肠炎的病原、症状、鉴别与防治措施[J];现代畜牧科技;2016年12期

8 方明辉;;猪增生性肠炎病的防治措施[J];山东畜牧兽医;2017年02期

9 宋虎成;张佑卿;李忠吉;;一起猪增生性肠炎的诊治报告[J];猪业科学;2017年04期

10 崔金霞;;规模猪场猪增生性肠炎的防控措施[J];中国畜牧兽医文摘;2017年07期

相关博士学位论文 前10条

1 王赵琛;医学情境下基因检测的伦理学探究[D];北京协和医学院;2014年

2 张锦海;四种自然疫源病原体可视化LAMP检测技术建立与现场检测箱组研制[D];第二军医大学;2015年

3 李雪莲;环介导等温扩增（LAMP）技术检测旋毛虫DNA的研究[D];郑州大学;2016年

4 殷继永;蛋白质芯片技术定量检测血清铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体方法的研究[D];中国疾病预防控制中心;2011年

5 周俊临;基于数据挖掘的分布式异常检测[D];电子科技大学;2010年

6 刘海龙;免疫入侵检测中检测器优化与多形态检测研究[D];哈尔滨理工大学;2013年

7 周鑫淼;兴奋剂生长激素检测方法的研究[D];北京体育大学;2012年

8 张抒;可视目标检测与分割关键技术研究[D];电子科技大学;2015年

9 徐鸣明;博尔纳病病毒多种检测方法的比较和细胞水平研究[D];重庆医科大学;2010年

10 朱磊;记忆源检测的特征与机制研究[D];华东师范大学;2009年

相关硕士学位论文 前10条

1 罗露;猪胞内劳森氏菌LAMP、PCR快速检测方法的建立及应用[D];四川农业大学;2015年

2 乐华波;江西省某猪场猪增生性肠炎感染情况调查及防制试验[D];江西农业大学;2012年

3 林婷婷;猪增生性肠炎三种检测方法（FIRSTtest、PCR和ELISA）的比较研究[D];福建农林大学;2017年

4 田城;猪胞内劳森菌检测方法的建立及其培养方法的初探[D];南京农业大学;2012年

5 李浩;食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞检测及临床意义的研究[D];济南大学;2015年

6 陈泳;孕妇B族链球菌感染荧光PCR检测技术的建立和应用[D];苏州大学;2015年

7 姜延龙;原料乳中金黄色葡萄球菌的分离及PCR检测[D];东北农业大学;2006年

8 李先飞;基于外貌特征的行人检测方法研究与软件实现[D];电子科技大学;2014年

9 肖娟;分布式话题检测方法研究[D];哈尔滨工业大学;2012年

10 陈杰;猪增生性肠炎诊断方法的研究[D];福建农林大学;2009年

本文编号：2886212