脱氧核酶对鸭甲肝病毒IRES元件的靶向抑制作用研究

发布时间：2017-04-06 11:07

  本文关键词：脱氧核酶对鸭甲肝病毒IRES元件的靶向抑制作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为寻找基因水平治疗鸭甲肝病毒(DHAV)的可行性靶位点,我们对DHAV的内部核糖体进入位点序列(Internal Ribosome Entry Site, IRES)元件设计合成了6条(DZ369、DZ454、DZ514、DZ454-7、DZ454-9和DZ000)脱氧核酶(DNAzyme),开展了DNAzyme对IRES元件切割、对DHAV复制的抑制作用研究,获得如下结果。以构建的pGEM-T/IRES质粒为模板,通过T7体外转录试剂盒进行体外转录得到含有IRES结构元件的RNA单链产物(DHAV-RNA),长度约为361m,在金属离子Mg2+存在的情况下,DHAV-RNA与DNAzyme进行相互作用后5.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果显示具有完整的酶切活性中心和与底物完全互补配对的侧翼结构的DZ369、DZ454和DZ514均能在靶RNA的G-C或者A-C位点进行切割反应,而只有完整酶切活性中心不具备切割底物的识别结构域的无关对照组DZ000,不能对靶RNA进行有效切割,表明DNAzyme对IRES的切割反应具有很强的特异性。DNAzymes需要二价金属离子的辅助才能更好地发挥作用,并且在不同金属离子的作用下,DNAzymes对IRES表现出不同的切割活性,其中Mg2+对DNAzymes的活性表现出最强的促进作用,其余依次是Zn2+、Mn2+、Ni2+和Co2+。将含有IRES结构元件的目的基因和Red基因克隆到pEGFP-N1中,得到双表达载体pEGFP-Red-IRES-N1并转染DEF细胞中,成功表达出Red和EGFP荧光蛋白。与阳性对照组相比,重组克隆载体的绿色荧光蛋白的表达量只能到达对照组的60-65%,且IRES依赖性的EGFP开始表达的时间比帽子依赖性的时间更延后,说明IRES能起始其下游基因的表达,但是活性没有CMV启动子的强。随后将双表达载体pEGFP-Red-IRES-N1和DNAzyme共转染DEF细胞,发现转染DNAzyme的试验组中EGFP表达受到了抑制,最强抑制作用出现在10μmol/L的DZ454组,而DNAzyme侧翼长度的改变没有影响其活性。与对照组相比Red蛋白的表达量没有差异,表明IRES起始的蛋白的表达是相对独立的。另外一个重要的结果是在DZ454对DHAV-1全病毒复制的抑制作用的试验中,用一步荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)的方法检测细胞碎片中不同时间点3D基因的表达情况。结果显示,到第60 h时病毒的复制量达到最大值,之后保持不变,且在病毒复制的整个过程中DZ454通过对IRES的剪切而发挥对DHAV-1复制的抑制作用,在第72 h时抑制率达到了最大值(10.38%),之后保持不变。综上,在有二价金属离子的参与下,DNAzyme能对DHAV的IRES的特定位点进行有效切割,在DEF中也对DHAV复制表现出了一定的抑制作用,结果为进一步探索DHAV感染的治疗提供了可参考的数据。
【关键词】：DHAV-1 IRES元件 脱氧核酶
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 部分缩写及符号说明6-10
• 1 文献综述10-17
• 1.1.1 型鸭甲肝病毒的简介10-11
• 1.1.1 DHAV-1的理化和生物学特性10
• 1.1.2 DHAV的分子结构10-11
• 1.1.3 常见病毒蛋白质的翻译机制11
• 1.2 IRES的研究概况11-16
• 1.2.1 IRES的发现及分类12
• 1.2.2 IRES的二级结构12-13
• 1.2.3 参与IRES翻译起始的调控因素13-14
• 1.2.4 IRES的应用及活性14-15
• 1.2.5 IRES在基因治疗中充当靶位点的作用15-16
• 1.3 脱氧核酶的研究概况16-17
• 1.3.1 脱氧核酶的发现16
• 1.3.2 脱氧核酶的特性16-17
• 1.3.3 脱氧核酶的应用17
• 1.4 选题目的及意义17
• 2 试验研究17-33
• 2.1 试验材料17-19
• 2.1.1 毒株和菌种17
• 2.1.2 主要试剂17-18
• 2.1.3 其他试验材料18
• 2.1.4 常用试剂的配制18-19
• 2.2 主要仪器设备19
• 2.3 试验方法19-33
• 2.3.1 DNAzymes对DHAV-RNA的体外切割试验19-25
• 2.3.2 含IRES结构元件的重组载体pEGFP-Red-IRES-N1构建25-29
• 2.3.3 在DEF中DNAzymes对IRES活性的抑制作用29-31
• 2.3.4 DZ454对DHAV-1全病毒复制的抑制作用31-33
• 3 试验结果33-47
• 3.1 DHAV-1 IRES的二级结构预测33
• 3.2 含有IRES结构元件目的基因的T克隆及体外转录33-35
• 3.2.1 目的基因的PCR扩增33-34
• 3.2.2 含有IRES结构元件目的基因的T克隆34
• 3.2.3 DHAV-RNA体外转录物完整性的检测34-35
• 3.3 DNAzymes对IRES的体外切割试验35-36
• 3.3.1 在Mg~(2+)参与下各种DNAzymes对IRES的切割作用35
• 3.3.2 在不同金属离子的参与下DNAzymes对IRES的切割作用35-36
• 3.4 重组质粒pEGFP-Red-IRES-N1的构建及表达36-40
• 3.4.1 含有IRES结构元件目的基因和Red基因的PCR扩增36-37
• 3.4.2 含有IRES结构元件目的基因和Red基因的T克隆37-38
• 3.4.3 含有IRES结构元件目的基因和Red基因的亚克隆38-39
• 3.4.4 重组质粒的表达39-40
• 3.5 在DEF中DNAzymes对IRES的抑制作用40-45
• 3.5.1 DNAzymes对细胞毒性的评估40-41
• 3.5.2 量效关系41-43
• 3.5.3 时效关系43-44
• 3.5.4 最适侧翼长度44-45
• 3.6 DZ454对DHAV-1复制的抑制作用45-47
• 3.6.1 TCID_(50)的测定45
• 3.6.2 标准曲线的构建45-46
• 3.6.3 样品的定量检测46-47
• 4 讨论47-50
• 5 结论50-51
• 参考文献51-58
• 致谢58

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