拉米夫定对禽白血病病毒的体内外抑制效应及其应用

发布时间：2017-04-06 11:09

  本文关键词：拉米夫定对禽白血病病毒的体内外抑制效应及其应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽白血病(Avian leukemia,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的禽类多种良性和恶性肿瘤性疾病,临床上多以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤等为主要特征,其传播主要通过垂直传播。此外,由于一些弱毒疫苗中污染了ALV也给规模化养鸡业和家禽疫苗产业带来了巨大的危害。目前尚无有效的商品化疫苗用于ALV的预防。ALV与人获得性免疫缺陷综合症病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)同属于反转录病毒,鉴于通过多种药物及其组合已经较好的控制了HIV,我们有兴趣知道类似的药物是否可以辅助降低外源性ALV的感染率或用于去除疫苗中ALV污染。本研究观察了逆转录酶抑制剂类药物拉米夫定(Lamivudine,LAM)对ALV-J在体外和体内的抑制作用并成功在模拟实验中将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)弱毒疫苗中ALV-A污染去除。1、不同浓度LAM对ALV-J体外抑制作用及其应用首先通过在不同药物浓度培养液中细胞的连续传代和CCK-8细胞毒性测定两种方法确定了在培养液中添加不超5 ug/ml的LAM对于DF-1细胞复制没有影响。为了解不同浓度LAM对ALV-J在体外的抑制作用,实验将J亚群r NX0101株接种到DF-1细胞上,然后在不同孔中分别使用20 ug/ml,10 ug/ml,5 ug/ml,1 ug/ml LAM的维持液培养以测定病毒复制动态。结果显示,5 ug/ml的安全用药范围内,其抗病毒作用与其浓度呈正相关,即随着药物浓度的增加,r NX0101的复制受到抑制作用随之增强。按照类似操作观察了LAM对ALV-A也有明显的抑制作用。将人为污染ALV-A的NDV疫苗毒种经过5 ug/ml的LAM连续干预2代后,经接种SPF鸡、病毒分离以及核酸检测确认成功将其中人为污染的ALV去除。2、药物选择压下ALV耐药毒株的产生经细胞活性实验和对病毒的抑制作用实验确定5 ug/ml为ALV复制被显著抑制但可以继续复制的药物浓度用于构建药物选择压,在6孔细胞板中分别设置用药组和空白组。连传60代后,将原始毒株、第六十代用药组病毒及第六十代未用药组病毒进行准确定量,以相同病毒量接种细胞,分别观察同等接种剂量在添加0 ug/ml和5 ug/ml的LAM后不同毒株复制曲线,结果显示5 ug/ml药物浓度下,对原始毒株抑制作用远远高于对药物选择压下的传代毒株,证实出现了对LAM产生耐药性的ALV-J毒株。3、不同剂量LAM对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用给不同组别的鸡分别使用不同剂量的LAM后通过定期称重并检测针对NDV和AIV-H9的抗体评估不同剂量LAM对鸡体重和免疫功能的影响,结果显示分别使用1mg,4 mg和6 mg的药物组其体重以及AIV-H9和NDV抗体与未空白对照组相比差异均不显著。将不同组别的鸡人工攻毒后分别使用不同剂量的药物连续用药一周,从第一周起每只鸡采集抗凝血检测各组病毒血症阳性率。结果显示,未使用LAM的ALV-J感染组在感染后21 d时有85.00%转为病毒血症阳性,并且直到105 d时还维持在一个较高的病毒血症水平(65.00%),而使用4 mg LAM的感染组在63 d时即转为病毒血症阴性。使用1 mg LAM的用药组尽管没有完全消除ALV-J的感染,但病毒血症阳性率也明显低于未使用药物的感染组。综上所述,本研究不仅证实了LAM对ALV-J在体内外的抑制作用并成功应用于降低ALV-J感染和去除ALV-A污染,还构建了药物选择压下ALV-J的连续传代系列,为进一步研究逆转录病毒耐药性产生的分子机制打下来良好的基础。
【关键词】：禽白血病病毒 拉米夫定 抑制作用 疫苗污染 耐药性
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 前言15-28
• 1.1 禽白血病病毒（ALV）的研究进展15-21
• 1.1.1 病原学15-17
• 1.1.2 病毒复制17-18
• 1.1.3 流行病学18-19
• 1.1.4 ALV-J致病性19-20
• 1.1.5 ALV-J抗体和病毒血症存在情况20
• 1.1.6 ALV-J的诊断20-21
• 1.1.7 ALV-J的预防21
• 1.2 HIV的研究进展21-27
• 1.2.1 病原学22
• 1.2.2 病毒的复制22-23
• 1.2.3 HIV的检测23
• 1.2.4 发病机理23-24
• 1.2.5 治疗药物24-27
• 1.2.6 HIV耐药性检测27
• 1.3 本试验研究的目的和意义27-28
• 2 材料和方法28-37
• 2.1 材料28-29
• 2.1.1 细胞、病毒与抗体28-29
• 2.1.2 药物与疫苗29
• 2.1.3 主要试剂及仪器29
• 2.2 方法29-37
• 2.2.1 不同浓度药物的配制29-30
• 2.2.2 细胞安全药物浓度的确定30
• 2.2.3 不同浓度LAM对ALV-J体外抑制实验30
• 2.2.4 ALV-p27抗原检测30-31
• 2.2.5 药物选择压下的细胞连续传代实验设计31-32
• 2.2.6 不同浓度LAM对海兰褐鸡生产性能影响实验设计32
• 2.2.7 体重指数测定32
• 2.2.8 NDV和AIV-H9灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定32
• 2.2.9 血凝血抑测定抗体滴度32-33
• 2.2.10 统计学分析33
• 2.2.11 不同剂量LAM对ALV-J在海兰褐鸡内复制的抑制实验33-34
• 2.2.12 病毒分离34
• 2.2.13 人工模拟应用LAM去除疫苗毒种中ALV-A污染实验34
• 2.2.14 抗体检测34-35
• 2.2.15 病毒RNA的提取35
• 2.2.16 RT-PCR35-36
• 2.2.17 斑点分子杂交36-37
• 3 结果37-43
• 3.1 DF-1 细胞安全药物浓度确定37-38
• 3.2 第六十代耐药毒株的验证38-39
• 3.3 不同LAM添加浓度对ALV-J体外复制的抑制作用39-40
• 3.4 不同浓度LAM对海兰褐鸡生长速度的影响40-41
• 3.5 不同浓度LAM对NDV和AIV-H9免疫的抗体反应的影响41-42
• 3.6 不同剂量LAM对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用42
• 3.7 应用LAM去除疫苗毒种中ALV-A污染42-43
• 4 讨论43-47
• 4.1 不同浓度LAM对ALV-J体外抑制实验44-45
• 4.2 药物选择压下耐药毒株的产生45
• 4.3 不同剂量LAM对ALV-J在海兰褐鸡内复制的抑制实验45-46
• 4.4 人工模拟应用LAM去除疫苗毒种中ALV-A污染实验46-47
• 5 结论47-48
• 6 参考文献48-56
• 7 致谢56-57
• 8 硕士期间发表的论文57

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 胡晓苗;张丹俊;侯宏艳;戴银;赵瑞宏;潘孝成;周学利;沈学怀;朱传明;;活毒疫苗中禽白血病病毒污染的检测方法探讨[J];安徽农业科学;2013年26期

2 秦爱建,刘岳龙,周绮雯,黄维嘉;J亚群禽白血病病毒的免疫荧光检测效果[J];中国预防兽医学报;2001年03期

3 杨玉莹,叶建强,赵振华,秦爱建,顾玉芳;禽白血病病毒J亚群内蒙株的分离与鉴定[J];中国病毒学;2003年05期

4 叶建强;秦爱建;邵红霞;金文杰;刘岳龙;;J亚群禽白血病病毒(ALV-J)ELISA检测方法的建立[J];中国兽医学报;2006年03期

5 冯小宇;徐镔蕊;Lucy F.Lee;Maoxiang Li;;蛋鸡J亚群禽白血病病毒的分离与初步鉴定[J];中国兽医杂志;2008年01期

6 杨守锋;邢红方;彭远义;;J亚型禽白血病病毒病原学及诊断方法研究进展[J];畜禽业;2009年04期

7 孙淼;李金彩;郭振华;曹红;常建宇;陈福勇;;J亚型禽白血病病毒的分离与鉴定[J];中国兽医杂志;2009年10期

8 郝春丽;胡梅;柴建亭;;禽白血病病毒特性的研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2010年01期

9 张在平;田进;孟庆文;马学恩;;Real-time RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒的研究[J];黑龙江畜牧兽医;2010年05期

10 侯新华;申茂欣;鹿欣伦;楚电峰;刘东;孙健;左青山;杜元钊;;蛋鸡血管瘤型J亚群禽白血病病毒的分离与鉴定[J];中国家禽;2011年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 杨玉莹;叶建强;赵振华;秦爱建;顾玉芳;;禽白血病病毒J亚群内蒙株的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年

2 王真真;蔡黎明;徐晴晴;王桂花;成子强;;外源体在禽白血病病毒诱导免疫抑制中的作用[A];2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集[C];2012年

3 李佳桃;汤承;岳华;;检测禽白血病病毒的荧光定量RT-PCR方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集[C];2007年

4 张太翔;凌宗帅;史玉颖;高小博;田国宁;张金玲;韩亮;张丽萍;;实时荧光定量RT-PCR检测禽白血病病毒方法的建立与应用[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（下册）[C];2009年

5 叶建强;秦爱建;邵红霞;金文杰;刘岳龙;;J亚群禽白血病病毒(ALV-J)ELISA检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年

6 秦爱建;刘岳龙;周绮雯;黄维嘉;;J亚群禽白血病病毒的免疫荧光检测效果[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C];2010年

7 廖亚琳;廖明;曹伟胜;;禽白血病病毒受体研究进展[A];第三届（2012）中国黄羽肉鸡行业发展大会会刊[C];2012年

8 孙淼;吴艳;郭振华;曾凡桂;曹红;郑世军;陈福勇;;J亚型禽白血病病毒分子流行病学调查及进化分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年

9 王彦军;孙淼;曹红;陈福勇;;禽白血病病毒自然感染及抗体变化动态规律[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2010年

10 顾小雪;韩雪;蔡林;张硕;李晓霞;汪葆s

本文编号：288762