JNK促进甲型流感病毒复制的分子机制

发布时间：2020-12-04 16:00

　　A型流感病毒（Influenza A Virus,IAV）广泛感染禽类与哺乳动物,而B型流感病毒只感染人类。基于病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同组合,IAV可以进一步分为多种亚型。目前为止,共鉴定出17种HA和10种NA。其中一些重组的IAV基因型（包括H5N1,H9N2,H7N2和H6N5）会引起人类的致命性感染。自噬是细胞对受损细胞器,废旧蛋白和入侵微生物进行吞噬降解和再利用的过程,已有越来越多的自噬相关蛋白被发现参与自噬的形成。自噬由液泡排列相关蛋白34（VPS34）活化引起,VPS34是种已知的III型磷脂酰肌醇激酶（PI3K-III）,其磷酸化底物磷脂酰肌醇（PI3P）可以和Beclin-1,ATG14L,VSP15组成蛋白复合物,为自噬小体形成所必需。ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可以与自噬相关蛋白13（ATG13）和分子量大小为200kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）相互作用。VPS34由ULK1激活,激活后PI-4,5将会被催化成PI3P,活化的蛋白复合物将用于参与自噬双层膜的形成并延长形成自噬体。ULK1的活性受哺乳动物雷帕霉素... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．?ＩＡＶ在ＣＥＦ和ＤＦ１细胞中诱导ＬＣ－３脂质化和ｐ６２降解

??接下来，我们用共聚焦显微镜检测来观察三种不同的ＩＡＶ病毒是否也差异性诱导自噻??小体的形成。如图２Ｂ所示，Ｈ５Ｎ１诱导的自噬小体成核周分布，和阳性对照雷帕霉素诱导??的细胞自噬相似。而Ｈ１Ｎ１诱导的自噬小体非常大聚集分布在核的一边。Ｈ９Ｎ２病毒诱导??的自噻小体大多分布在细胞核附近一侧。三种亚型ＩＡＶ病毒均能诱导３０％左右的细胞量产??生自噬，阳性对照雷帕霉素能诱导１５％左右的细胞产生自嗤（图２Ｃ）。??Ａ?Ｂ??ＤＡＰＩ?ＧＦＰ－ＬＣ３?Ｍｅｒｇｅ??則：＇??图２．三种亚型流感病毒差异性诱导细胞自噬。（Ａ）不同ＩＡＶ亚型（Ｈ５Ｎ１，?Ｈ９Ｎ２，?Ｈ１Ｎ１）用指定浓??度感染０￡？细胞２４小时。裂解细胞后用＾＾５１６１１１８１〇１检测１￡：３－１１，？６２，＾１１，及＾－３（：１；：１１１的蛋白表达水??平。（Ｂ）稳定转染表达ｐｍＬＣ３－ＧＦＰ的ＤＦ－１细胞分别感染Ｈ５Ｎ１?（０．１?ＭＯＩ），?Ｈ９Ｎ２?（１?ＭＯＩ）和Ｈ〗Ｎ１?（１??ＭＯＩ）。雷帕霉素（５０ｎＭ）作用未感染细胞作为阳性对照。药物作用或病毒感染１２小时后，在共聚焦??显微镜下观察自噬小体。比例尺，２５ｐｍ。计算产生自噬小体的ＧＲＰ阳性表达的ＤＦ１细胞比例，并绘制??条形图。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。??

ａｎｄ?ｐｌｏｔｔｅｄ?ｉｎ?ａ?ｂａｒ?ｇｒａｐｈ?ｗｉｔｈ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ?ａｎａｌｙｓｉｓ?（Ｃ）．?＊ｐ＜０．０５；?＊＊ｐ＜０．０１．??为了验证Ｈ５Ｎ１病毒诱导细胞完全自噬的能力，我们分别用巴弗洛霉素Ａ（Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ??Ａ，Ｂａｆ）和氯唾（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ，ＣＱ）两种自噬抑制剂来阻断自噬流的形成。；碑过图３Ａ＆Ｂ??可以发现，ＣＱ和Ｂａｆ增强了?Ｈ５Ｎ１诱导的ＬＣ３－ＩＩ的增加，并阻断了由Ｈ５Ｎ１诱导引起的??ｐ６２的降解。与此相反的是，ＣＱ和Ｂａｆ对Ｈ１Ｎ１感染细胞中的ｐ６２水平与ＬＣ３－ＩＩ的变化??几乎没有影响。ＤＦ１细胞感染Ｈ５Ｎ１病毒的荧光共聚焦结果同样可以证明，Ｈ５Ｎ１诱导细??胞完全自噬。如图３Ｃ所示，Ｂａｆ?（１０ｎＭ）或者Ｈ５Ｎ１病毒（０．１ＭＯＩ）可以显著增加自噻??小体的形成，表现为ＧＦＰ－ＬＣ３荧光聚点的数量增加。ＤＦ１细胞感染Ｈ５Ｎ１病毒后加入Ｂａｆ??可以进一步增加ＧＦＰ－ＬＣ３荧光聚点的数量（图３Ｄ）。?备??我们接下来验证是否阻断了自噬会影响ＩＡＶ的胞内复制。如图３Ｅ所示，ＣＥＦ细胞感??染Ｈ５Ｎ１后加入Ｂａｆ，分别检测胞内病毒蛋白的含量和细胞培养上清中病毒蛋白的含量。??结果显示


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