DON、ZEA联合染毒对体外培养猪脾脏淋巴细胞凋亡及氧化损伤的研究

发布时间：2017-04-08 07:13

  本文关键词：DON、ZEA联合染毒对体外培养猪脾脏淋巴细胞凋亡及氧化损伤的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是饲料中两种最常见的霉菌毒素。DON、ZEA不仅降低饲料营养价值、降低动物生长和繁殖性能,而且还损伤机体免疫能力,导致疾病。霉菌毒素的免疫毒性日渐受到重视。本研究以原代培养猪脾脏淋巴细胞为模型,应用CCK-8法测得猪脾脏淋巴细胞染毒48h后,DON、ZEA的半数抑制浓度(IC50)分别为1.48±0.20μg/mL和2.03±0.3μg/mL,表明DON、ZEA均能够影响猪脾脏淋巴细胞的增殖活性。在此基础上设计DON单独染毒剂量水平为0.06μ/mL,0.3μg/mL/1.5μg/mL, ZEA单独染毒剂量水平为0.08μg/mL,0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL, DON和ZEA联合染毒剂量为0.06μg/mL和0.08μg/mL、0.3μg/mL和0.4μg/mL、1.5μg/mL和2μg/mL,另设对照组。猪脾脏淋巴细胞单独或联合染毒DON、ZEA 48h后,检测抗氧化功能、细胞凋亡、凋亡相关基因p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8 mRNA表达水平及培养液上清中相关的凋亡基因蛋白含量,以此来探知DON、ZEA单独或联合染毒对猪脾脏淋巴细胞凋亡和氧化损伤的影响及机制,为阐明其免疫毒性机制提供依据。试验结果：(1)与对照组比较,除DON、ZEA单独染毒最低剂量组个别指标外,其余染毒组SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量均显著降低(P0.05或P0.01),MDA含量极显著增加(P0.01),且具有一定剂量依赖关系；联合染毒组对5个指标的作用效应大于相应剂量单独染毒组,呈亚加性效应。(2)DON、ZEA单独染毒组细胞凋亡率均极显著高于对照组(P0.01),且呈剂量依赖效应；联合染毒组中细胞凋亡率均极显著高于相应的单独染毒组(P0.01),表现出亚加性效应。(3)与对照组比较,除DON、ZEA单独染毒最低剂量组个别指标外,各染毒组p53、Bax、Caspase-3及Caspase-8含量和mRNA表达水平均显著增加(P0.05或P0.01),而Bcl-2含量和mRNA表达水平则显著降低(P0.05或P0.01),这种变化呈现剂量依赖关系；联合染毒组对上述指标的影响大于相应剂量单独染毒组,呈亚加性效应。结论：(1)DON、ZEA单独染毒可剂量依赖性导致体外培养的猪脾脏淋巴细胞氧化损伤,氧化损伤与细胞凋亡程度一致,表明氧化损伤途径是导致细胞凋亡的机制之一。(2)DON、ZEA单独染毒可剂量依赖性使Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低,上调p53、Caspase-3和Caspase-8的基因表达,表明DON和ZEA通过激活p53和Caspase通路而诱导细胞凋亡,且凋亡受到Bcl-2家族蛋白的调控。(3)联合染毒对猪脾脏淋巴细胞氧化损伤及细胞凋亡的影响主要表现出亚加性效应。
【关键词】：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) 玉米赤霉烯酮(ZEA) 脾脏淋巴细胞 氧化损伤 细胞凋亡
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.8
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文缩写词表8-12
• 第一章 文献综述12-23
• 1 DON毒性作用研究进展13-16
• 1.1 DON的免疫毒性13-14
• 1.2 DON与氧化损伤14-15
• 1.3 DON与细胞凋亡15-16
• 1.3.1 DON的细胞凋亡毒性机制16
• 2 ZEA毒性作用研究进展16-20
• 2.1 ZEA的免疫毒性17
• 2.2 ZEA与氧化损伤17-18
• 2.3 ZEA与细胞凋亡18-20
• 2.3.1 ZEA的细胞凋亡毒性机制19-20
• 3 DON与ZEA在不同动物的毒性互作效应研究20-22
• 3.1 猪20-21
• 3.2 鼠21
• 3.3 家禽21
• 3.4 其他动物21-22
• 4 研究的目的意义22-23
• 第二章 DON、ZEA联合染毒对体外培养猪脾脏淋巴细胞氧化损伤的研究23-35
• 1 材料与方法23-25
• 1.1 材料23-24
• 1.1.1 试验动物23
• 1.1.2 主要仪器23
• 1.1.3 主要试剂23-24
• 1.2 方法24-25
• 1.2.1 猪脾脏淋巴细胞悬液的制备24
• 1.2.2 试验设计操作程序24-25
• 2 检测指标及方法25
• 2.1 DON、ZEA单独染毒的细胞半数抑制浓度(IC_(50))的检测25
• 2.2 细胞内抗氧化功能的检测25
• 3 数据的分析与统计25-26
• 4 结果与分析26-30
• 4.1 DON、ZEA单独染毒的细胞半数抑制浓度(IC_(50))的结果26-27
• 4.2 细胞内抗氧化功能的变化27-30
• 4.2.1 抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性及GSH含量的变化27-29
• 4.2.2 丙二醛(MDA)含量的变化29-30
• 5 讨论30-34
• 5.1 DON、ZEA及其联合染毒对猪脾脏淋巴细胞增殖抑制率的影响30-32
• 5.2 DON、ZEA及其联合染毒对猪脾脏淋巴细胞内抗氧化功能的影响32-34
• 6 小结34-35
• 第三章 DON、ZEA联合染毒对体外培养猪脾脏淋巴细胞凋亡的研究35-53
• 1 材料与方法35-36
• 1.1 材料35-36
• 1.1.1 试验动物35
• 1.1.2 主要仪器35
• 1.1.3 主要试剂35-36
• 1.2 方法36
• 1.2.1 猪脾脏淋巴细胞悬液的制备36
• 1.2.2 试验设计操作程序36
• 2 检测指标及方法36-39
• 2.1 细胞凋亡率的检测36
• 2.2 上清液中p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8含量的测定36-37
• 2.3 细胞内凋亡相关基因p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8的mRNA的表达37-39
• 2.3.1 引物设计与合成37
• 2.3.2 细胞总RNA的提取37-38
• 2.3.3 反转录合成cDNA38-39
• 2.3.4 目的基因RT-qPCR条件的优化39
• 2.3.5 Real Time PCR扩增39
• 3 数据的分析与统计39-40
• 4 结果与分析40-49
• 4.1 细胞凋亡率的变化40-41
• 4.2 培养上清液中p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8含量的变化41-45
• 4.2.1 上清液中p53、Caspase-3及Caspase-8含量的变化41-43
• 4.2.2 上清液中Bcl-2及Bax含量的变化43-45
• 4.3 细胞内凋亡相关基因p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8的mRNA的表达45-49
• 4.3.1 p53、Caspase-3及Caspase-8基因mRNA表达的变化45-47
• 4.3.2 Bcl-2及Bax基因mRNA表达的变化47-49
• 5 讨论49-52
• 5.1 DON、ZEA及其联合染毒对猪脾脏淋巴细胞凋亡的影响49-50
• 5.2 DON、ZEA及其联合染毒对猪脾脏淋巴细胞凋亡相关基因p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-8的影响50-52
• 5.2.1 Caspase基因家族50
• 5.2.2 bcl-2基因家族50-51
• 5.2.3 p53基因51-52
• 6 小结52-53
• 结论53-54
• 参考文献54-66
• 致谢66-67
• 攻读学位期间发表的学术论文67

【参考文献】

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本文编号：292342