pcDNA4/myc-His/exJSRV-env转染NIH3T3细胞的研究

发布时间：2020-12-18 13:03

　　绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）引发的绵羊肺腺瘤病（OPA）,是绵羊的一种慢性进行性传染性肺脏肿瘤疾病。JSRV具有与其他逆转录病毒相似的结构和基因组,基因组包含了编码病毒衣壳结构蛋白的gag基因,编码天冬氨酸蛋白酶（PR）的pro基因,编码逆转录酶（RT）和整合酶（IN）的pol基因以及编码存在与病毒粒子表面的囊膜蛋白（Env）的env基因。其中囊膜蛋白主要负责病毒粒子与病毒的靶细胞的特异性结合,同时发生膜融合使病毒粒子侵入靶细胞内,是主要的致癌蛋白。为了进一步探索exJSRV囊膜蛋白的功能,从而揭示JSRV的致癌机制。本研究以自然感染的OPA的病肺组织为原料提取总RNA并反转录成cDNA,构建含完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因（exISRV-env）的重组质粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env,并通过PCR、酶切和核酸测序方法鉴定其正确性。采用脂质体转染技术将重组质粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env瞬时转染NIH3T3细胞,利用RT-PCR和Western blot方法检测Env的表达,利用CCK-8法和平板克隆形成实验检测囊膜蛋白Env表达对NIH3... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 绵羊肺腺瘤概述
    1.2 绵羊肺腺瘤病毒
    1.3 JSRV囊膜蛋白
    1.4 JSRV囊膜蛋白引起的致癌信号通路
    1.5 研究OPA发病机制的实验方法
        1.5.1 羔羊体内疾病模型
        1.5.2 自然感染的OPA
        1.5.3 小鼠体内肿瘤模型
        1.5.4 体外细胞培养模型
        1.5.5 OPA的体外肺片模型
    1.6 细胞转染
    1.7 检测细胞增殖的方法
        1.7.1 检测代谢活性
        1.7.2 检测DNA合成
        1.7.3 检测ATP浓度
        1.7.4 检测增殖标志
    1.8 研究目的与意义
2 试验一 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白真核表达载体pcDNA4/myc-His/exJSRV-env构建及鉴定
    2.1 试验材料
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 设计引物
        2.2.2 exJSRV-env的克隆
        2.2.3 目的基因的纯化
        2.2.4 S组质粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-enw的构建及鉴定
    2.3 结果
        2.3.1. exJSRV-env的克隆
        2.3.2 pcDNA4/myc-His/exJSRV-env构建及鉴定结果
        2.3.3 测序结果
    2.4 讨论
3 试验二 pcDNA4/myc-His-exJSRV-env瞬时转染NIH3T3细胞
    3.1 试验材料
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 复苏NIH3T3细胞
        3.2.2 细胞传代
        3.2.3 pcDNA4/myc-His/exJSRV-env瞬时转染NIH3T3细胞
        3.2.4 细胞转染后exJSRV-env mRNA表达的检测
        3.2.5 Western blot检测Env在NIH 3T3细胞中的表达
    3.3 结果
        3.3.1 pcDNA4/myc-His/exJSRV-env转染NIH3T3细胞后目的基因的检测
        3.3.2 Western blot检测Env的表达情况
    3.4 讨论
4 试验三 瞬时转染pcDNA4/myc-His-exJSRV-env对NIH3T3细胞的影响
    4.1 试验材料
        4.1.1 主要材料
        4.1.2 主要仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 CCK8法检测细胞体外增殖能力
        4.2.2 平板克隆形成实验
        4.2.3 Western blot检测EGFR
    4.3 结果
        4.3.1 CCK8法检测细胞增殖
        4.3.2 平板克隆形成实验
        4.3.3 Western blot检测EGFR
    4.4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]绵羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env构建及引起NIH3T3细胞恶性转化的研究[J]. 张宇飞,刘月,王专家,孙晓林,刘淑英.  病毒学报. 2014(03)



本文编号：2924044