猪伪狂犬病病毒变异株gE/gl/TK三基因缺失株的构建及免疫效力初步研究
发布时间：2020-12-28 12:10
猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的多种家畜及野生动物共患的一种广泛流行的急性传染病,以发热、奇痒（除猪外）、呼吸及神经系统疾病为特征,妊娠母猪发生流产或死胎。该病在猪场多呈暴发流行,目前尚无治疗PR的有效药物,因此疫苗接种是控制该病发生和流行的主要措施。自2011年以来,我国多个省份接种疫苗的猪群中发生严重的猪伪狂犬病,新出现的伪狂犬病病毒变异株对各个年龄的猪均具有致病性,意味着现有疫苗可能不能对当前流行株提供完全的保护,使我国养猪业面临巨大风险。本研究以实验室分离的猪伪狂犬病变异株PRV-XJ株为材料,通过Cre-loxP系统构建了不带标记基因的gE/gI双缺失株及gE/gI/TK三缺失株,对重组病毒的生长特性及免疫保护力进行了初步探究,为研制伪狂犬病变异株重组疫苗及病毒载体疫苗奠定基础。1、伪狂犬病毒gE/gI双缺失株及gE/gI/TK三基因缺失株的构建以vPRV-XJ株基因组DNA为模板,分别扩增gE/gI基因、TK基因两侧序列作为同源臂,以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,构建带有loxp位点的...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＰＲＶ病毒粒子结构模式图??Ｆｉｇ．?１－１．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＲＶ?ｖｉｒｉｏｎ?ｓｔｍｃｌｕｒｅ［１６］??
?李爽：猪伪狂犬病病毒变异株ｇＥ／ｇｌ／ＴＫ三基因缺失株的构建及免疫效力初步研究?３＿??１．３病毒分子生物学特征??１．３．１?ＰＲＶ基因组??ＰＲＶ的基因组为线性双股ＤＮＡ?（图卜２）?［１８］，基因组庞大约为１４５?ｋｂ，与ＥＨＶ－１，??ＢＨＶ－１和ＶＺＶ相似，其基因组在结构上分为４部分：包括大小为９５?ｋｂ的长独特区（Ｕｎｉｑｕｅ??ｌｏｎｇ；ＵＬ）和９ｋｂ的短独特区（Ｕｎｉｑｕｅｓｈｏｒｔ；ＵＳ）、ＵＳ区两侧的末端重复序歹ｉｊ?（ＴＲ）和内??部重复序列（ｍｙ１６１。因为ＰＲＶ的基因组ＵＳ区两侧存在重复序列，所以病毒在复制过程??中能产生两种同分异构体，这两种同分异构体均具有感染性，具有相同的生物活性，且在??感染机体内等量存在［１６，｜７］。基因组Ｇ＋Ｃ含量高达７４．５％，结构复杂，是疱疹病毒中Ｇ＋Ｃ??含量最高的［６，１７１。目前，ＰＲＶ整个基因组的测序工作已经完成，通过多项研究和试验数据??分析结果证明，ＰＲＶ基因组含有７０个以上基因，６７个开放阅读框，可以编码７０到１００个??蛋白质，但其中有大约一半基因是病毒复制非必需的，可以在这些基因之间作为载体加入外??源基因序列。??
对测序正确的质粒Ｔ－ＧＦＰ用及ｍ双酶切，将ＧＦＰ基因片段连接到相同酶处??理的ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ质粒上，转化后摇菌提取质粒进行酶切鉴定，将正确的重组质粒命名为??ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ?（图１－１）。鉴定正确的菌液使用甘油冻存，－７０°Ｃ保存备用。??２．６?ｇＥ／ｇｌ双基因缺失株的构建及纯化??２．６．１重组质粒ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ的提取??按照Ｏｍｅｇａ公司去内毒素的质粒提取试剂盒Ｐｌａｓｍｉｄ?Ｍｉｎｉ?Ｋｉｔｎ，Ｖ（ｃａｐｐｅｄ）?Ｓｐｉｎ说明书??操作。??２．６．２转移载体ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ与ＰＲＶ基因组的共转染??采用磷酸钙方法进行转染，参考Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司磷酸钙转染试剂盒说明书操作，具体??步骤如下：??（１）
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J]. 尹文玲,尹龙勃,叶伟成,孙学强,姚火春,张淼涛,王一成,张存. 病毒学报. 2010(04)
[2]伪狂犬病基因缺失苗的研究进展[J]. 冯烁. 福建畜牧兽医. 2010(03)
[3]表达猪源流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒的构建[J]. 李敏,向华,张丽,黄元,王贵平,宣华. 中国人兽共患病学报. 2009(10)
[4]猪伪狂犬病病毒gD核酸疫苗构建及IL-15基因佐剂对其免疫增强试验[J]. 岳玉红,郭万柱,韩国全,林华,袁章,徐志文,王小玉. 中国兽医学报. 2009(10)
[5]家兔效验猪伪狂犬病灭活疫苗免疫效果的初步研究[J]. 张莉,丁伯良,王英珍,鄢明华,韩伟. 中国畜牧兽医. 2009(05)
[6]表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定[J]. 陈瑾,田志军,彭金美,王瑜,周艳君,安同庆,童光志. 中国预防兽医学报. 2009(01)
[7]伪狂犬病病毒Bartha K61株Us区缺失片段的鉴定[J]. 彭金美,陈瑾,田志军,王瑜,周艳君,安同庆,童光志. 中国兽医科学. 2008(08)
[8]从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因[J]. 苏鑫铭,于春梅,王敏秀,陈勇军,曹瑞兵,周斌,陈溥言. 病毒学报. 2006(06)
[9]猪伪狂犬基因工程疫苗研究进展[J]. 樊淑华,李文刚,吴凤笋,卢中华. 郑州牧业工程高等专科学校学报. 2005(02)
[10]伪狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒种特性研究[J]. 陈陆,郭万柱,殷华平,查光明. 中国病毒学. 2005(02)
硕士论文
[1]表达绿色荧光蛋白的猪伪狂犬病病毒与猪细小病毒VP2基因的重组病毒的构建[D]. 杨慧敏.河南农业大学 2009
本文编号：2943730
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＰＲＶ病毒粒子结构模式图??Ｆｉｇ．?１－１．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＲＶ?ｖｉｒｉｏｎ?ｓｔｍｃｌｕｒｅ［１６］??
?李爽：猪伪狂犬病病毒变异株ｇＥ／ｇｌ／ＴＫ三基因缺失株的构建及免疫效力初步研究?３＿??１．３病毒分子生物学特征??１．３．１?ＰＲＶ基因组??ＰＲＶ的基因组为线性双股ＤＮＡ?（图卜２）?［１８］，基因组庞大约为１４５?ｋｂ，与ＥＨＶ－１，??ＢＨＶ－１和ＶＺＶ相似，其基因组在结构上分为４部分：包括大小为９５?ｋｂ的长独特区（Ｕｎｉｑｕｅ??ｌｏｎｇ；ＵＬ）和９ｋｂ的短独特区（Ｕｎｉｑｕｅｓｈｏｒｔ；ＵＳ）、ＵＳ区两侧的末端重复序歹ｉｊ?（ＴＲ）和内??部重复序列（ｍｙ１６１。因为ＰＲＶ的基因组ＵＳ区两侧存在重复序列，所以病毒在复制过程??中能产生两种同分异构体，这两种同分异构体均具有感染性，具有相同的生物活性，且在??感染机体内等量存在［１６，｜７］。基因组Ｇ＋Ｃ含量高达７４．５％，结构复杂，是疱疹病毒中Ｇ＋Ｃ??含量最高的［６，１７１。目前，ＰＲＶ整个基因组的测序工作已经完成，通过多项研究和试验数据??分析结果证明，ＰＲＶ基因组含有７０个以上基因，６７个开放阅读框，可以编码７０到１００个??蛋白质，但其中有大约一半基因是病毒复制非必需的，可以在这些基因之间作为载体加入外??源基因序列。??
对测序正确的质粒Ｔ－ＧＦＰ用及ｍ双酶切，将ＧＦＰ基因片段连接到相同酶处??理的ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ质粒上，转化后摇菌提取质粒进行酶切鉴定，将正确的重组质粒命名为??ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ?（图１－１）。鉴定正确的菌液使用甘油冻存，－７０°Ｃ保存备用。??２．６?ｇＥ／ｇｌ双基因缺失株的构建及纯化??２．６．１重组质粒ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ的提取??按照Ｏｍｅｇａ公司去内毒素的质粒提取试剂盒Ｐｌａｓｍｉｄ?Ｍｉｎｉ?Ｋｉｔｎ，Ｖ（ｃａｐｐｅｄ）?Ｓｐｉｎ说明书??操作。??２．６．２转移载体ｐＢＫＳｇＩＬｇＥＲ－ＧＦＰ与ＰＲＶ基因组的共转染??采用磷酸钙方法进行转染，参考Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司磷酸钙转染试剂盒说明书操作，具体??步骤如下：??（１）
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J]. 尹文玲,尹龙勃,叶伟成,孙学强,姚火春,张淼涛,王一成,张存. 病毒学报. 2010(04)
[2]伪狂犬病基因缺失苗的研究进展[J]. 冯烁. 福建畜牧兽医. 2010(03)
[3]表达猪源流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒的构建[J]. 李敏,向华,张丽,黄元,王贵平,宣华. 中国人兽共患病学报. 2009(10)
[4]猪伪狂犬病病毒gD核酸疫苗构建及IL-15基因佐剂对其免疫增强试验[J]. 岳玉红,郭万柱,韩国全,林华,袁章,徐志文,王小玉. 中国兽医学报. 2009(10)
[5]家兔效验猪伪狂犬病灭活疫苗免疫效果的初步研究[J]. 张莉,丁伯良,王英珍,鄢明华,韩伟. 中国畜牧兽医. 2009(05)
[6]表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定[J]. 陈瑾,田志军,彭金美,王瑜,周艳君,安同庆,童光志. 中国预防兽医学报. 2009(01)
[7]伪狂犬病病毒Bartha K61株Us区缺失片段的鉴定[J]. 彭金美,陈瑾,田志军,王瑜,周艳君,安同庆,童光志. 中国兽医科学. 2008(08)
[8]从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因[J]. 苏鑫铭,于春梅,王敏秀,陈勇军,曹瑞兵,周斌,陈溥言. 病毒学报. 2006(06)
[9]猪伪狂犬基因工程疫苗研究进展[J]. 樊淑华,李文刚,吴凤笋,卢中华. 郑州牧业工程高等专科学校学报. 2005(02)
[10]伪狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒种特性研究[J]. 陈陆,郭万柱,殷华平,查光明. 中国病毒学. 2005(02)
硕士论文
[1]表达绿色荧光蛋白的猪伪狂犬病病毒与猪细小病毒VP2基因的重组病毒的构建[D]. 杨慧敏.河南农业大学 2009
本文编号：2943730
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