PRRSV/GSWW/2015株病毒特征分析与重组病毒拯救技术体系建立

发布时间：2021-01-02 04:43

　　猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的,以母猪繁殖障碍和各年龄猪呼吸困难为特征的疫病。2006年,我国爆发高致病性PRRS（highly pathogenic PRRS,HP-PRRS）,对我国养猪业造成了巨大的经济损失,其危害一直持续至今。2015年甘肃武威某猪场发生典型的PRRS症状,我们对采集的病料进行了病毒分离与鉴定。通过Marc-145细胞分离病毒,RT-PCR和N蛋白间接免疫荧光检测确定为PRRSV感染阳性。随后测定了PRRSV GSWW株全基因组序列,并与国内外参考毒株比对分析。系统进化分析表明,GSWW株属于第Ⅲ亚群,于nsp2编码区存在30个氨基酸的不连续缺失。GP5蛋白主要中和抗原表位氨基酸突变,中和表位附近出现新的糖基化位点N34。因此,GSWW分离株是我国流行的高致病性毒株。为了进一步研究GSWW分离株的致病性和免疫学特性,我们选取了24头PRRSV阴性猪进行感染试验,其中17头以108拷贝数病毒量鼻腔攻毒,7头进行同居感染。攻毒与同... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 PRRS概述
    1.2 PRRSV基因组结构及编码蛋白
    1.3 PRRSV遗传变异
    1.4 PRRSV感染性克隆构建
    1.5 PRRSV感染性克隆基因操作
    1.6 PRRSV感染性克隆的应用
        1.6.1 嵌合病毒和病毒的细胞嗜性与表型研究
        1.6.2 新型PRRS疫苗研究
        1.6.3 PRRSV外源基因表达载体
        1.6.4 PRRSV结构和功能研究
    1.7 PRRSV免疫学特性
    1.8 PRRSV在中国的控制
    1.9 本研究的目的和意义
第二章 PRRSV GSWW株分离鉴定与遗传变异分析
    2.1 材料和方法
        2.1.1 试剂和细胞
        2.1.2 仪器设备
        2.1.3 病料采集
        2.1.4 病原检测
        2.1.5 PRRSV全基因组序列测定
    2.2 结果
        2.2.1 细胞病变（CPE）观察
        2.2.2 RT-PCR检测
        2.2.3 PRRSV N蛋白间接免疫荧光检测
        2.2.4 GSWW全基因组序列扩增
        2.2.5 PRRSV遗传变异分析
    2.3 讨论
第三章 PRRSV GSWW株攻毒感染试验
    3.1 材料和方法
        3.1.1 病毒、试剂及仪器
        3.1.2 动物试验
        3.1.3 临床症状及病理学观察
        3.1.4 荧光定量PCR检测
        3.1.5 ELISA检测PRRSV N蛋白抗体
        3.1.6 ELISA检测 γ 干扰素
    3.2 结果
        3.2.1 临床症状
        3.2.2 病毒血症
        3.2.3 PRRSV N蛋白抗体
        3.2.4 γ干扰素检测
    3.3 讨论
第四章 表达FMDV B7多表位基因的重组PRRSV的拯救
    4.1 材料和方法
        4.1.1 病毒株与细胞
        4.1.2 试剂和仪器
        4.1.3 引物和表位设计
        4.1.4 重组PRRSV感染性cDNA克隆的构建
        4.1.5 重组质粒线性化
        4.1.6 RNA体外转录
        4.1.7 重组PRRSV病毒拯救
        4.1.8 RT-PCR扩增B7多表位基因
        4.1.9 荧光定量PCR测定病毒拷贝数
    4.2 结果
        4.2.1 重组PRRSV体外转录
        4.2.2 拯救病毒细胞病变（CPE）及绿色荧光观察
        4.2.3 拯救病毒vFl12-B7 RT-PCR扩增与序列测定
        4.2.4 重组PRRSV传代稳定性
        4.2.5 荧光定量PCR检测重组PRRSV
    4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：2952675