乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

发布时间：2021-01-04 21:40

　　乙型脑炎是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）侵害中枢神经系统引起的急性传染病。我国每年大约有2万多例的乙脑患者,20%-30%的乙脑患者死亡。乙型脑炎属于自然疫源性疾病,多种动物均可感染,其中人、马、猴、驴感染后会出现明显的临诊症状,病死率比较高。猪群感染乙脑比较常见,死亡率比较低,且大多不出现临诊症状。怀孕母猪感染乙脑可表现为高热、流产、死胎和木乃伊胎,公猪则表现为睾丸炎。JEV属于黄病毒科,黄病毒属,病毒粒子直径为30-40nm。JEV的结构蛋白有C、PrM/M、E三种,其中E蛋白是乙脑病毒的主要结构蛋白,在免疫性和致病性方面起着重要的作用。E蛋白的单体结构包含三个结构域,结构域Ⅲ（EDⅢ）为免疫球蛋白样折叠的结构域,是受体的主要结合部位,有高度的免疫原性。这个区域在病毒的诊断分析中是非常有价值的。此外,单克隆抗体具有特异性好、纯度高、效价高、成本低、可大量生产等优势,在实验室检测、蛋白纯化与功能研究、疾病的诊断与治疗、抗原表位鉴定方面等有很大的开发价值。本研究以实验室保存的含pET-28a-EDⅢ质粒的甘油菌诱导表达的EDⅢ蛋白皮下... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 文献综述
    第一章 乙型脑炎的研究进展
        1 乙型脑炎病毒的病原特征
            1.1 乙型脑炎病毒的分类及形态
            1.2 乙型脑炎病毒的生物学特征
            1.3 乙型脑炎病毒的培养特性
            1.4 乙型脑炎病毒对外界的抵抗力
            1.5 乙型脑炎病毒的致病性
        2 乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白研究进展
            2.1 乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的重要性
            2.2 乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的研究进展
        3 乙型脑炎的流行情况
            3.1 乙型脑炎的流行特点
            3.2 乙型脑炎的分布区域
            3.3 乙型脑炎的发病规律
        4 乙型脑炎的诊断、预防和治疗
            4.1 乙型脑炎的诊断
                4.1.1 乙型脑炎的临诊症状
                4.1.2 乙型脑炎的病理变化
                4.1.3 乙型脑炎的临床诊断
            4.2 乙型脑炎的预防
                4.2.1 免疫接种
                4.2.2 杜绝传播媒介
            4.3 乙型脑炎的治疗
                4.3.1 乙型脑炎的一般性治疗
                4.3.2 乙型脑炎的对症治疗
                4.3.3 乙型脑炎的抗病毒治疗
        5 单克隆抗体技术和应用
            5.1 单克隆抗体的研究进展
            5.2 单克隆抗体技术
                5.2.1 嵌合单克隆抗体技术
                5.2.2 噬菌体抗体库技术
                5.2.3 核糖体展示技术
                5.2.4 RNA-多肽融合技术
                5.2.5 转基因小鼠制备全人类抗体
            5.3 单克隆抗体的应用
                5.3.1 单克隆抗体在免疫组织化学中的应用
                5.3.2 单克隆抗体在病毒学中的应用
                5.3.3 单克隆抗体在细菌学中的应用
                5.3.4 单克隆抗体在寄生虫中的应用
            5.4 乙型脑炎病毒单克隆抗体研究进展
        参考文献
第二部分 实验研究
    第二章 乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
        1 材料
            1.1 实验动物、细胞系、菌种
            1.2 主要试剂
            1.3 仪器和设备
        2 方法
            2.1 EDⅢ蛋白的诱导表达及纯化
                2.1.1 EDⅢ蛋白的诱导表达
                2.1.2 EDⅢ蛋白的亲和层析纯化
                2.1.3 纯化的EDⅢ蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析
                2.1.4 EDⅢ蛋白Western-blot分析
            2.2 小鼠的免疫
            2.3 间接ELISA方法测血清效价
            2.4 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
                2.4.1 SP2/0骨髓瘤细胞的复苏
                2.4.2 SP2/0骨髓瘤细胞的筛选及扩大培养
            2.5 饲养细胞的准备
            2.6 脾细胞的准备
            2.7 细胞融合
            2.8 EDⅢ杂交瘤细胞株的建立
                2.8.1 阳性杂交瘤细胞的筛选
                2.8.2 亚克隆
                2.8.3 杂交瘤细胞的冻存
            2.9 腹水的制备
            2.10 单克隆抗体的鉴定
                2.10.1 单克隆抗体效价的测定
                2.10.2 单克隆抗体Ig亚类的鉴定
                2.10.3 单克隆抗体的特异性鉴定
                2.10.4 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性的鉴定
                2.10.5 间接免疫荧光试验（IFA）
        3 结果
            3.1 EDⅢ蛋白的诱导表达、纯化及Western-blot鉴定
                3.1.1 EDⅢ蛋白的诱导表达及纯化
                3.1.2 EDⅢ蛋白的Western-blot鉴定
            3.2 EDⅢ蛋白单克隆抗体的鉴定
                3.2.1 EDⅢ蛋白单抗效价的测定
                3.2.2 EDⅢ蛋白单抗亚型的测定
                3.2.3 EDⅢ蛋白单抗特异性鉴定
                3.2.4 EDⅢ蛋白单抗分泌稳定性的鉴定
                3.2.5 间接免疫荧光试验（IFA）
        4 讨论
        参考文献
    第三章 EDⅢ蛋白单克隆抗体对病毒中和作用的研究
        1 材料
            1.1 细胞和病毒
            1.2 试剂
            1.3 仪器和设备
        2 方法
            2.1 乙型脑炎病毒NJ2008株的扩增
                2.1.1 鼠脑扩增乙型脑炎病毒NJ2008株
                2.1.2 乙型脑炎病毒NJ2008株的鉴定
            2.2 空斑形成试验检测乙脑病毒NJ2008株的毒价
            2.3 空斑减少试验检测1C3单抗的中和活性
            2.4 结果判定
            2.5 乳鼠脑内接种单抗和病毒
        3 结果
            3.1 乙型脑炎病毒NJ2008株的Western-blot鉴定
            3.2 空斑形成试验测乙脑病毒NJ2008株的毒价
            3.3 空斑减少试验测1C3单抗中和活性
            3.4 乳鼠发病情况统计
            3.5 乳鼠鼠脑组织解剖观察
            3.6 乳鼠鼠脑组织和脾脏的HE染色
        4 讨论
        参考文献
全文总结
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪乙型脑炎间接ELISA与血凝抑制试验方法的比较[J]. 贾杏林,陈焕春,王祥,何启盖,吴斌.  中国畜牧兽医. 2011(02)
[2]抗原表位研究方法进展[J]. 宋帅,李春玲,贾爱卿,杨冬霞,李淼.  动物医学进展. 2010(12)
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[5]猪乙型脑炎的诊断与科学防治[J]. 赵以云,王强,左瑞华.  畜牧与饲料科学. 2009(Z1)
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博士论文
[1]猪乙型脑炎减毒活疫苗与基因免疫研究[D]. 王祥.华中农业大学 2001

硕士论文
[1]河南省乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因进化分析[D]. 卜丹.郑州大学 2010
[2]日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用[D]. 孙圣福.华中农业大学 2004



本文编号：2957415