亲环蛋白A对PRRSV增殖的影响及其作用机制研究

发布时间：2021-01-10 00:34

　　猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一种传染病,临床上主要表现为母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状及高死亡率。1987年美国首次发现该病,1996年我国首次分离到PRRSV （CH-1a株）。近二十年来,PRRS在我国多次爆发,尤其是2006年我国出现的高致病性猪蓝耳病病毒株,使该病在我国猪群中持续流行,给防控带来很大挑战,也给养猪业造成重大经济损失。亲环蛋白家族各成员在生物体内广泛存在且高度保守,具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,通过催化含脯氨酸的寡肽底物的顺反异构帮助蛋白质正确折叠和组装。目前有超过60种的亲环蛋白家族成员被发现,其中亲环蛋白A （CypA）作为免疫抑制药物环孢素A （CsA）的细胞内作用靶点最早从牛胸腺细胞中被分离出来,是亲环蛋白家族最典型的代表,而且是最早发现且含量最丰富的亲环蛋白家族成员。近年来,关于CypA的研究主要集中在其对病毒感染的作用上,如丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型、甲型流感病毒、轮状病毒等。为探讨CypA在PRRSV感染过程中的作用,我们开展了以下研究：1. PRRSV感染对CypA表达的影响... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语表
第1章 文献综述
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒
        1.1.1 PRRS概述
        1.1.2 PRRSV病原学特征
        1.1.3 PRRSV基因组结构特征
        1.1.4 PRRSV Nsp1β与天然免疫研究进展
        1.1.5 PRRSV与炎症反应
    1.2 CypA及其生物学功能
    1.3 CypA与炎症
    1.4 CypA与肿瘤
    1.5 CypA与病毒感染
    1.6 蛋白质相互作用的研究方法
第2章 研究目的和意义
第3章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞、毒株与菌株
        3.1.2 载体与质粒
        3.1.3 工具酶及主要试剂
        3.1.4 Western Blot以及CO-IP实验所需材料
        3.1.5 培养基及其配制
        3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
            3.1.6.1 构建质粒用缓冲液及其试剂
            3.1.6.2 Western Blot用缓冲液及其试剂
            3.1.6.3 其它缓冲液及其试剂
        3.1.7 主要实验仪器及设备
        3.1.8 分子生物学分析软件
    3.2 实验方法
        3.2.1 原代PAM细胞的分离
        3.2.2 PRRSV的扩增（Marc-145及PAM细胞）
        3.2.3 病毒滴度的测定（空斑实验）
        3.2.4 抑制剂的配制及其细胞毒性检测
        3.2.5 细胞样品总RNA的提取、RT-PCR及实时定量PCR
            3.2.5.1 总RNA的提取
            3.2.5.2 cDNA的合成
            3.2.5.3 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR
            3.2.5.4 相对mRNA表达水平的计算
        3.2.6 限制性内切酶酶切反应
        3.2.7 PCR产物或酶切产物的电泳检测
        3.2.8 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
        3.2.9 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
        3.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
        3.2.11 连接产物的转化
        3.2.12 重组质粒的制备与鉴定
            3.2.12.1 质粒的小量制备
            3.2.12.2 质粒的大量制备
            3.2.12.3 质粒DNA的定量
            3.2.12.4 重组质粒（阳性质粒）的鉴定
        3.2.13 siRNA和质粒的转染（脂质体介导的瞬时转染法）
        3.2.14 双荧光素酶报告基因检测
        3.2.15 Western Blot检测目的基因在真核细胞中的表达
            3.2.15.1 样品制备
            3.2.15.2 SDS-PAGE电泳
            3.2.15.3 Western Blot检测分析
        3.2.16 免疫共沉淀
            3.2.16.1 样品制备及处理
            3.2.16.2 Western Blot检测互作蛋白
        3.2.17 间接免疫荧光检测蛋白质的亚细胞定位
        3.2.18 酵母双杂交筛选互作蛋白
            3.2.18.1 酵母感受态细胞的制备
            3.2.18.2 质粒转化酵母感受态细胞
            3.2.18.3 酵母融合质粒的自激活检测
            3.2.18.4 酵母融合质粒的细胞毒性检测
        3.2.19 统计学方法
第4章 结果与分析
    4.1 PRRSV感染对CypA的影响
        4.1.1 PRRSV感染对CypA表达的影响
        4.1.2 PRRSV感染对CypA细胞定位的影响
    4.2 CypA表达对PRRSV增殖的影响
        4.2.1 猴源CypA真核表达质粒的构建与CypA的表达验证
        4.2.2 猴源CypA干扰分子的合成与验证
        4.2.3 超表达及干扰CypA对PRRSV增殖的影响
        4.2.4 抑制剂CsA对PRRSV增殖的影响
            4.2.4.1 CsA对Marc-145和PAM细胞的毒性检测
            4.2.4.2 Marc-145细胞中CsA对PRRSV增殖的影响
            4.2.4.3 PAM细胞中CsA对PRRSV增殖的影响
    4.3 CsA对PRRSV诱导的炎症反应的影响
        4.3.1 CsA抑制PRRSV感染诱导的MAPK信号通路
        4.3.2 CsA抑制PRRSV感染诱导的炎症因子的表达
    4.4 与CypA相互作用的PRRSV编码蛋白的确定
        4.4.1 CypA及PRRSV编码蛋白酵母表达质粒的构建
        4.4.2 与CypA相互作用的PRRSV编码蛋白的筛选
        4.4.3 CypA与PRRSV Nsp1β相互作用的验证
    4.5 与CypA相互作用的PRRSV Nsp1β结构域的确定
        4.5.1 PRRSV Nsp1β截短突变体酵母表达质粒的构建
        4.5.2 与CypA相互作用的PRRSV Nsp1β结构域的筛选
        4.5.3 与CypA相互作用的PRRSV Nsp1β结构域的验证
    4.6 相互作用的蛋白及抑制剂CsA对IFN-β启动子活性的影响
        4.6.1 CypA和抑制剂CsA对IFN-β启动子活性的影响
        4.6.2 PRRSV Nsp1β截短突变体对IFN-β启动子活性的影响
第5章 讨论与结论
    5.1 讨论
        5.1.1 PRRSV感染对CypA表达的影响
        5.1.2 CypA的表达对PRRSV的影响
        5.1.3 抑制剂CsA对PRRSV诱导的炎症反应的影响
        5.1.4 CypA与PRRSV相互作用机制的初步研究
        5.1.5 相互作用的蛋白及抑制剂CsA对IFN-β启动子活性的影响
    5.2 结论
参考文献
致谢



本文编号：2967708