鸡马立克病发病与meq、pp38、PRNP、SPRN、akt基因表达量之间的相关性研究

发布时间：2017-04-28 18:16

  本文关键词：鸡马立克病发病与meq、pp38、PRNP、SPRN、akt基因表达量之间的相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【目的】为探明meq、pp38、PRNP、SPRN、akt在MD鸡体内的表达规律以及与鸡马立克病发病之间的关系,本研究拟用MDV-MD5毒株复制鸡MD肿瘤病例,通过Real-time PCR对meq、pp38、PRNP、SPRN和akt基因m RNA水平的相对转录量进行检测,分析攻毒鸡各组织中的表达变化规律,探讨上述基因表达量与MDV感染以及与MD肿瘤形成、发生、发展之间的相关性,为进一步研究它们在肿瘤发病学中的作用提供理论依据。【方法】(1)通过琼脂扩散、分子生物学以及蚀斑试验对MDV-MD5毒株进行鉴定,以人工攻毒建立鸡MD肿瘤病例,从攻毒60d开始,每隔30d剖检感染阳性鸡和对照鸡,150d全部扑杀,记录感染率、死亡率和致瘤率。(2)通过病理组织学观察,将150d的感染鸡分成肿瘤病变鸡、无肿瘤病变鸡和阴性对照鸡。(3)每个实验组随机选取3只,无菌采集14个组织样品,提取各样品总RNA并反转录,以c DNA为模板进行meq、pp38、PRNP、SPRN、akt和β-actin的Real-time PCR,分析3个实验组鸡14个不同组织样品间各基因在m RNA水平的相对转录差异。【结果】(1)经琼脂扩散、RT-PCR扩增meq和pp38以及蚀斑试验鉴定MD5毒株为阳性,TCID50=10-5.6363/0.1m L,以MD5株复制内脏型MD肿瘤病例。30d后经RT-PCR检测,感染率为85.42%,攻毒60d后出现死亡,90d剖检肉眼最早发现肿瘤,肿瘤发生率为17.07%,死亡率为24.39%,肿瘤多见于肝脏、脾脏和肾脏。(2)MD有肿瘤病变鸡的多个内脏有肿瘤病变,表面和切面有大小不等、质地坚硬的灰白色结节,镜下正常组织结构被破坏,有大量的淋巴细胞浸润。MD无肿瘤病变鸡和阴性对照鸡未见明显的病理组织学变化。(3)3个实验组中14个组织样品meq、pp38、PRNP、SPRN和akt的m RNA转录水平,meq仅在MDV攻毒鸡中表达,阴性对照鸡中不表达。除心脏和卵巢外,其余12个肿瘤病变组织meq的表达量均高于无病变组织;肿瘤病变鸡眼睑、卵巢和胰腺pp38表达量与无病变鸡相比差异不显著(P0.05),其余11个肿瘤病变组织pp38的表达量均高于无肿瘤病变鸡;除肌胃和肠外,其余12个肿瘤病变组织PRNP的表达量均高于无病变鸡和对照鸡,脾脏和肾脏的表达差异最高。无肿瘤病变鸡14个组织相对于对照鸡表达差异不显著(P0.05);SPRN在肌胃中不表达,腺胃、肠和眼睑中微量表达。除皮肤和坐骨神经,肿瘤病变鸡其余8个组织SPRN的表达量均高于对照鸡。无肿瘤病变鸡14个组织SPRN的表达量与对照鸡相比差异不显著(P0.05);肿瘤病变鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和皮肤相比于对照鸡akt表达量差异显著(P0.05),其余8个肿瘤病变组织与对照鸡相比差异不显著(P0.05)。无肿瘤病变鸡14个组织akt的表达量与对照鸡相比差异不显著(P0.05)。MD肿瘤组织肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤中,meq、pp38、PRNP、akt同时过表达,而除肺脏外,SPRN的表达量无明显变化。【结论】(1)本试验成功复制出鸡MD肿瘤病例。(2)Real-time PCR检测发现,MDV标志性基因meq和pp38在MD肿瘤病变鸡中显著表达,meq表达量与肿瘤的形成相关,pp38表达量与肿瘤的形成不相关。(3)PRNP表达量与MDV感染相关联,PRNP在MDV攻毒鸡组织中过表达。PRNP的差异表达与肿瘤组织病变程度呈正相关,肿瘤组织病变越严重,PRNP表达量的上调幅度越大;(4)SPRN在鸡组织中的表达量与MDV感染以及MD肿瘤的形成均不相关,且与PRNP的表达量也不相关;(5)MDV感染不引起akt表达量上调,akt在MD肿瘤组织中过表达。(6)meq、pp38、PRNP、akt在MD肿瘤组织中同时过表达,而SPRN的表达量无明显变化。
【关键词】：鸡马立克病 meq pp38 PRNP SPRN akt
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要3-4
• Summary4-8
• 缩略词中英文对照表8-9
• 第一章 绪论9-20
• 1.1 鸡马立克病的国内外研究进展9-16
• 1.1.1 病原学9-12
• 1.1.2 流行病学特性12
• 1.1.3 临床症状和病理变化12-13
• 1.1.4 发病机制13-15
• 1.1.5 致瘤相关基因15-16
• 1.2 PRNP基因16-17
• 1.3 SPRN基因17
• 1.4 akt基因17-18
• 1.5 研究目的和意义18-19
• 1.6 研究内容和方法19-20
• 1.6.1 MD肿瘤病例的复制19
• 1.6.2 马立克病鸡组织中meq、pp38、PRNP、SPRN、akt基因表达量的测定19-20
• 第二章 鸡马立克病肿瘤病例的复制20-27
• 2.1 材料与方法20-23
• 2.1.1 药品和试剂20
• 2.1.2 主要仪器20
• 2.1.3 毒株、鸡胚和动物20
• 2.1.4 CEF的制备20-21
• 2.1.5 病毒的增殖21
• 2.1.6 MDV的鉴定21-22
• 2.1.7 MDV细胞半数感染量（TCID50）的测定22
• 2.1.8 MDV的蚀斑试验22
• 2.1.9 MDV人工攻毒22
• 2.1.10 MD5毒株攻毒的感染率、死亡率和致瘤率22-23
• 2.2 结果与分析23-26
• 2.2.1 琼脂扩散试验23
• 2.2.2 总RNA的提取23
• 2.2.3 MDV的meq、pp38基因RT-PCR扩增检测23-24
• 2.2.4 MD5的蚀斑试验24-25
• 2.2.5 MDV的TCID50的测定25
• 2.2.6 MD5毒株攻毒鸡的感染率、死亡率和致瘤率25
• 2.2.7 MD5攻毒肿瘤鸡的各内脏发生肿瘤情况25-26
• 2.3 讨论26-27
• 第三章 马立克病鸡组织中meq、pp38、PRNP、SPRN、akt的表达量测定27-41
• 3.1 材料与方法28-29
• 3.1.1 病料来源28
• 3.1.2 主要试剂28
• 3.1.3 病理组织学观察28
• 3.1.4 引物设计与合成28
• 3.1.5 各组织样品总RNA的提取28
• 3.1.6 cDNA的合成28-29
• 3.1.7 组织样品meq、pp38、PRNP、SPRN、akt的mRNA表达量测定29
• 3.1.8 数据处理29
• 3.2 结果29-39
• 3.2.1 病理组织学观察29-32
• 3.2.2 各组织样品总RNA的提取结果32
• 3.2.3 RT-PCR检测结果32-33
• 3.2.4 荧光定量引物的特异性检测33
• 3.2.5 各组织样品中meq的mRNA表达量测定33-34
• 3.2.6 各组织样品中pp38的mRNA表达量测定34
• 3.2.7 各组织样品中PRNP的mRNA表达量测定34-37
• 3.2.8 各组织样品中SPRN的mRNA表达量测定37
• 3.2.9 各组织样品中akt的mRNA表达量测定37-38
• 3.2.10 肿瘤组织中meq、pp38、PRNP、SPRN和akt的表达差异38-39
• 3.3 讨论39-41
• 结论41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-51
• 作者简介51-52
• 导师简介52-53

【参考文献】

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本文编号：333330