肠出血性大肠杆菌O157:H7鞭毛蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

发布时间：2023-05-09 19:12

　　肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC) O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属,能引起人类的腹泻、出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis, HC)、溶血性尿毒综合症(Hemolyticuremic syndrome, HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenicpurpura, TTP)等严重疾病,可在动物肠道内长期寄居,对人类的健康及畜牧业危害巨大。其感染流行已经成为全球性的公共卫生问题。对于该病的防范不可懈怠,所以建立一种快速、准确、便捷的诊断检测方法十分必要。 H7蛋白为EHEC O157:H7的鞭毛蛋白,决定着大肠杆菌的血清型。有关研究表明,EHEC O157:H7与结肠黏膜上皮细胞或者黏液结合的过程发生在菌体在动物体内定植的早期,而鞭毛在这期间起着物理性的连接点的作用。而其在诱导产生天然的免疫反应的同时可产生前炎症因子,并且可以诱导产生抗原特异性的免疫反应。所以,H7鞭毛全长蛋白在制备特异性的检测抗体时是不可或缺的免疫原。在国内外之前的研究中用类似免疫方法制...

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号说明
文献综述
    1 病原学
    2 流行病学
        2.1 传染源
        2.2 传播途径
        2.3 易感人群
    3 主要毒力因子及致病作用
        3.1 志贺毒素
        3.2 pO157质粒
        3.3 LEE致病岛
            3.3.1 Eae基因
            3.3.2 Tir基因
            3.3.3 编码Ⅲ型分泌系统(esc或sep)及其分泌蛋白(esp)的基因
    4 致病机理及临床特征
        4.1 致病机理
        4.2 临床特征
    5 检测方法
        5.1 细菌分离法检测
        5.2 免疫学检测方法
            5.2.1 免疫磁珠法
            5.2.2 免疫荧光法
            5.2.3 凝集试验法
            5.2.4 胶体金免疫检测技术
        5.3 分子生物学检测方法
            5.3.1 聚合酶链反应(PCR)技术
            5.3.2 基因芯片技术
            5.3.3 生物传感技术
    6 防治
    7 实验目的及意义
研究一 大肠杆菌O157：H7鞭毛蛋白的原核表达
    摘要
    1 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 工具酶与试剂
        1.3 培养基及常用溶液
        1.4 主要仪器
    2 方法
        2.1 EHEC O157：H7鞭毛flic基因的扩增
        2.2 pMD18-T-Flic质粒的构建及筛选
        2.3 pET-28a-Flic质粒的构建及筛选
        2.4 His-Flic-H7融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析
        2.5 融合蛋白His-Flic-H7的大量表达及纯化
        2.6 融合蛋白His-Flic-H7的Western-blot分析
    3 结果
        3.1 Flic基因的扩增
        3.2 pMD18-T-Flic重组质粒的鉴定
        3.3 重组质粒pET-28a-Flic的鉴定
        3.4 His-Flic-H7融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析
        3.5 His-Flic-H7融合蛋白的大量诱导及纯化
        3.6 His-Flic-H7融合蛋白的Western-blot
    4 讨论
研究二 大肠杆菌O157：H7鞭毛蛋白的单克隆抗体制备
    摘要
    1 材料
        1.1 细胞和抗原
        1.2 实验动物
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器
        1.5 主要培养基
    2 方法
        2.1 小鼠的免疫
        2.2 细胞融合
        2.3 阳性克隆的筛选
        2.4 杂交瘤细胞的亚克隆
        2.5 腹水的制备
        2.6 单克隆抗体的亚类鉴定
        2.7 单克隆抗体的特异性检测
        2.8 单克隆抗体效价的检测
    3 结果
        3.1 血清及包被抗原的工作浓度的确定
        3.2 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
        3.3 单克隆抗体亚类的鉴定
        3.4 单克隆抗体的特异性检测
        3.5 抗体效价的检测
    4 讨论
参考文献
研究结论
致谢



本文编号：3812228