与鸭C4结合蛋白互作的鸭疫里默菌外膜蛋白的筛选及鉴定

发布时间：2023-05-13 02:54

　　旨在筛选并鉴定与鸭C4结合蛋白(C4b-binding protein,C4BP)互作的鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)外膜蛋白。本研究将保存的R.anatipestifer复苏培养,提取外膜蛋白,以鸭C4BPα作为诱饵蛋白进行His pull-down及LC-MS/MS蛋白质谱鉴定,筛选与鸭C4BP可能发生互作的候选外膜蛋白;将各候选蛋白进行克隆、原核表达,免疫小鼠制备多克隆抗体,利用Far-western blot验证与鸭C4BP发生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白;针对候选蛋白及C4BPα各功能结构域进行克隆及原核表达,利用Far-western blot鉴定候选蛋白及与C4BP的相互作用位点;利用ELISA对补体因子C3b、C4b及C4BP在R.anatipestifer表面沉积情况进行测定,验证候选蛋白的功能。结果显示,经His pull-down及LC-MS/MS蛋白质谱分析,共筛选出3个与鸭C4BP发生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白,即ECE-1、SODs和Omp62;成功获...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 试验动物
        1.1.2 菌株和载体
        1.1.3 主要试剂
    1.2 方法
        1.2.1 R. anatipestifer外膜蛋白的提取
        1.2.2 His pull-down试验筛选R.
        1.2.3 蛋白质谱鉴定R.
        1.2.4 候选蛋白编码基因原核表达及多克隆抗体制备
        1.2.5 Far-western blot鉴定R.anatipestifer与C4BP的相互作用
        1.2.6 R. anatipestifer外膜蛋白ECE-1与C4BP相互作用的位点鉴定
2 结 果
    2.1 与C4BP互作的R. anatipestifer候选外膜蛋白的筛选
    2.2 候选蛋白ECE-1、SODs及Omp62多克隆抗体制备
    2.3 Far-western blot鉴定候选外膜蛋白与C4BP的相互作用
    2.4 ECE-1与C4BP相互作用位点的鉴定
    2.5 ECE-1抗体对补体因子沉积的影响
3 讨 论
4 结 论



本文编号：3815154