黏附侵袭性大肠杆菌fliC、fimH基因缺失株的构建及相关功能性分析

发布时间：2023-05-19 22:45

　　黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasive Escherichia coli,AIEC)与肠道感染的发生发展密切相关,其毒力因子影响自身在肠上皮和巨噬细胞内的存活与复制,近年来受到广泛关注的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)可能与该致病菌密切相关。AIEC引发IBD的致病机理目前尚不明确,其鞭毛和菌毛被认为是主要的两大致病因子。AIEC菌株中基因fliC编码的鞭毛蛋白是鞭毛丝的主要结构亚基,参与细菌的一系列致病过程。Ⅰ型菌毛中fimH亚单位作为Ⅰ型菌毛的主要组成部分,在介导细菌黏附宿主细胞的同时,为进一步侵入机体创造条件。本研究以鞭毛蛋白FliC和Ⅰ型菌毛主要结构亚单位FimH为切入点,探究其在AIEC中所发挥的生物学作用,从而更好地理解AIEC的致病机理。首先通过比对NCBIGenBank上不同大肠杆菌E.coli菌株的E.ciku菌株的H基因序列,设计相应的PCR引物用于扩增检测AIEC菌株LF82(Wild-type,083:H1)中的fliC、fimH基因,对扩增后基因产物进行纯化、克隆以及序列测定。依据LF82的fliC、f...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
符号说明
文献综述 黏附侵袭性大肠杆菌鞭毛、菌毛结构及其致病性研究进展
    1 AIEC
    2 鞭毛、菌毛的结构形态及相关生物学特性
    3 AIEC致病性
        3.1 生物被膜形成
        3.2 黏附、侵袭
        3.3 免疫调节
    4 其它相关毒力因子
    5 小结
    参考文献
试验研究
    研究一、LF82鞭毛亚单位基因fliC、Ⅰ型菌毛亚单位基因fimH缺失株及相应回补株的构建
        1 材料
            1.1 菌株、质粒
            1.2 培养基、主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 fliC、fimH基因缺失引物设计
            2.2 融合PCR产物的制备与纯化
            2.3 感受态细胞制备过程、电化学转化过程
                2.3.1 电转化感受态细胞制备
                2.3.2 质粒pKD46的电转化过程
                2.3.3 Red同源重组酶诱导、感受态细胞制备
            2.4 氯霉素抗性基因cat PCR产物的电转化过程
            2.5 一次同源重组菌△fliC::cat、△fimH::cat、△fliC△fimH::cat PCR鉴定
            2.6 FLP位点专一性重组
            2.7 二次重组菌△fliC、△fimH、△fliC△fimH的鉴定
            2.8 回补株的构建
        3 结果
            3.1 融合PCR产物
            3.2 一次同源重组菌△fliC::cat、△fimH:cat、△fliC△fimH::cat的PCR鉴定
            3.3 二次重组菌△fliC、△fimH、△fliC△fimH的鉴定
            3.4 回补株的构建
        4 讨论
        参考文献
    研究二、LF82鞭毛蛋白FliC、Ⅰ型菌毛主要亚单位FimH介导的相关功能探索
        1 材料
            1.1 菌株、质粒、细胞系
            1.2 主要试剂及其配用方法
            1.3 主要仪器设备
            1.4 实验动物
        2. 方法
            2.1 生长曲线测定
            2.2 半固体运动试验
            2.3 生物被膜定量试验
            2.4 Caco-2细胞黏附、侵袭试验
                2.4.1 Caco-2细胞的培养、传代方法
                2.4.2 Caco-2细胞黏附试验
                2.4.3 Caco-2细胞侵袭试验
            2.5 Caco-2细胞黏附抑制试验
            2.6 Real-time PCR定量分析试验
                2.6.1 细菌总RNA的提取方法
                2.6.2 基因组DNA的去除方法
                2.6.3 反转录过程
                2.6.4 Real-time PCR
                2.6.5 数据的分析、处理
            2.7 小鼠肠道细菌定植试验
                2.7.1 实验动物
                2.7.2 细菌培养与计数
                2.7.3 小鼠肠道细菌定植试验具体方法
                2.7.4 数据处理分析
        3. 结果
            3.1 生长曲线测定结果分析
            3.2 细菌运动性鉴定结果
            3.3 生物被膜定量试验结果数据分析
            3.4 Caco-2细胞黏附试验结果分析
            3.5 Caco-2细胞侵袭试验结果分析
            3.6 Caco-2细胞黏附抑制试验结果分析
            3.7 fliC和fimH缺失对其他毒力因子表达的影响
            3.8 小鼠肠道定植试验
        4 讨论
        参考文献
全文小结
论文创新点
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录



本文编号：3820018