CRISPR/Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因在山羊β-乳球蛋白基因座定点敲入

发布时间：2023-05-22 00:42

　　为研究山羊乳蛋白基因编辑,实现羊乳"人源化"改造。利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳中致敏原β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点敲入人乳铁蛋白(hLF)基因。针对山羊BLG基因第一外显子设计构建sgBLG/Cas9表达载体经电转染山羊胎儿成纤维细胞验证其编辑活性;将打靶载体BLC14与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经筛选检测获得BLG^-/hLF⁺打靶细胞株作为供核细胞用于山羊体细胞核移植;通过剖宫产获取克隆胎儿并验证其中靶情况。结果表明:sgBLG/Cas9编辑山羊BLG位点致突变率约为30%～35%;共筛选72株药物抗性细胞株,其中有37株为基因打靶细胞,打靶效率为51.4%(37/72);挑取形态较好的7株打靶细胞用于核移植,共制备416枚重构胚,移植30只受体山羊;30-35日龄B超诊断有13只受孕,妊娠率为43.3%(13/30);剖宫产获取3只35日龄克隆胎儿均验证为BLG^-/hLF⁺基因型,并建立了BLG^-/hLF^+...

【文章页数】：9 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 试验材料
    1.2 引物设计及合成
    1.3 sgRNA设计及sgBLG/Cas9表达载体构建
    1.4 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离及培养
    1.5 CRISPR/Cas9编辑山羊BLG位点致突变活性检测
    1.6 CRISPR/Cas9系统介导的hLF基因打靶细胞系的建立
    1.7 转基因克隆山羊的制备
    1.8 基因打靶克隆胎儿鉴定
2 结果与分析
    2.1 sgBLG/Cas9介导的山羊BLG基因座的打靶原理
    2.2 山羊胎儿成纤维细胞的形态结构
    2.3 CRISPR/Cas9编辑山羊胎儿成纤维细胞的BLG位点活性检测
    2.4 hLF基因打靶细胞系的检测
    2.5 克隆胚的发育情况及基因打靶的验证
3 讨论与结论



本文编号：3821668