小鼠Zfy基因RNAi病毒载体的构建及性控效果的观察

发布时间：2023-08-02 18:06

　　本研究采用逆转录病毒载体介导的RNAi技术靶向抑制性别决定相关基因Zfy的表达，研究Zfy基因在生精过程中的相关功能及小鼠后代性别比例的变化。通过构建逆转录病毒载体Retrovirus/Zfy-shRNA和质粒载体Psilencer/Zfy-shRNA，用构建好的病毒载体和质粒载体转染小鼠生精细胞，应用qRT-PCR检测各组细胞中Zfy基因的mRNA表达水平,验证干扰载体对Zfy基因的沉默效应。大量包装生产病毒颗粒和制备质粒载体并对公鼠进行睾丸打点注射，每隔7d注射1次，连续注射4次，最后一次注射14d后，部分雄鼠宰杀采集睾丸组织，qRT-PCR检测Zfy基因的表达水平；另一部分雄鼠与每组超排处理的雌鼠按1:1合笼，间隔5d合笼1批雌鼠，共合笼3批，观察后代的性别比例。 结果显示，逆转录病毒Retrovirus/Zfy-shRNA和质粒载体Psilencer/Zfy-shRNA转染小鼠生精细胞后，Zfy基因mRNA表达水平都极显著低于空载体对照组和空白对照组（P<0.01），两对照组之间无差异显著性（P>0.05）；睾丸注射逆转录病毒Retrovirus/Zfy-shRNA...

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
论文中常用缩写词英汉对照表
引言
第一篇 研究综述
    1 性别决定基因研究进展
        1.1 Zfy基因
        1.2 Sry基因
        1.3 Sox-9基因
        1.4 Gata-4基因
        1.5 Sf-1基因
        1.6 Wt-1基因
        1.7 总结和展望
    2 病毒载体介导RNA干扰的研究进展
        2.1 病毒载体系统简介
        2.2 稳定RNA干扰载体
        2.3 高效RNA干扰载体
        2.4 诱导RNA干扰载体
        2.5 标记RNA干扰载体
        2.6 目的细胞特异性RNA干扰载体
        2.7 问题与展望
    3 RNAi作用机制及RNAi技术在动物繁殖中的应用
        3.1 RNAi作用机制
        3.2 RNAi技术在动物繁殖中的应用
        3.3 展望
第二篇 实验研究
    实验一：小鼠Zfy基因RNAi逆转录病毒载体的构建
        1. 实验材料
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 载体、菌株及细胞
        2. 实验方法
            2.1 重组逆转录病毒载体的构建
            2.2 逆转录病毒的包装与病毒滴度测定
        3. 实验结果
            3.1 shRNA表达序列的设计与合成
            3.2 重组逆转录病毒表达载体的测序鉴定
            3.3 逆转录病毒包装及滴度测定
        4. 讨论
    实验二：逆转录病毒载体介导的RNAi体外调控Zfy基因表达的实验研究
        1. 实验材料
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 实验动物
        2. 实验方法
            2.1 Zfy基因RNA干扰逆转录病毒载体的构建及病毒包装
            2.2 重组RNAi质粒载体Psilencer/Zfy-shRNA的大量制备与纯化
            2.3 小鼠生精细胞的分离培养
            2.4 逆转录病毒感染小鼠生精细胞及质粒载体转染小鼠生精细胞
            2.5 荧光实时定量PCR测定生精细胞中Zfy基因mRNA的表达水平
        3. 实验结果
            3.1 小鼠生精细胞分离培养的形态学特征
            3.2 逆转录病毒载体对小鼠生精细胞的感染效果
            3.3 生精细胞中Zfy基因mRNA的表达水平
        4. 讨论
    实验三：调控Zfy基因表达对小鼠后代性别影响的实验研究
        1. 实验材料
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 实验动物
        2. 实验方法
            2.1 Zfy基因RNA干扰逆转录病毒载体的构建及病毒包装
            2.2 重组RNAi质粒载体Psilencer/Zfy-shRNA的大量制备与纯化
            2.3 小鼠体内RNA干扰实验
            2.4 荧光实时定量PCR测定睾丸组织中Zfy基因mRNA的表达水平
            2.5 受孕雌鼠的饲养和后代小鼠的性别鉴定
        3. 实验结果
            3.1 PCR产物扩增结果
            3.2 睾丸组织中Zfy基因mRNA的表达水平
            3.3 小鼠后代性别比例
            3.4 病毒载体和质粒载体在小鼠体内作用时间
        4. 讨论
全文小结
创新点
参考文献
致谢
作者简介
导师评阅表



本文编号：3838331