基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1 gE缺失株及其生物学特性初步鉴定

发布时间：2023-08-02 18:09

　　牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)可引发牛传染性鼻气管炎,对养牛业造成巨大经济损失。近年来,国内外均开展了牛鼻气管炎疫苗的研制。对于传统疫苗,灭活苗不能或很少引起细胞免疫而弱毒苗具有毒性和抗药性;对于新型疫苗,亚单位苗不能在体内复制,大多DNA疫苗也只能引起部分的体液免疫,然而,基因缺失疫苗具有免疫标识,利用缺失的基因可以进行野生型感染和疫苗免疫的诊断,已成为新型疫苗研究开发的主流。为了更高效地构建基因缺失疫苗,本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑与同源重组技术,构建带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记并缺失糖蛋白E基因(glycoprotein E,gE)的重组BHV-1病毒,命名为BHV-1 gE^-/EGFP⁺。随后通过特异性的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)敲除BHV-1 gE^-/EGFP⁺病毒基因组中的EGFP基因,该gE基因缺失株命名为BHV-1ΔgE。利用脂质体法将pCas9-mCherry质...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词表
第一章 牛鼻气管炎疫苗的研究进展
    1 牛鼻气管炎概况
        1.1 牛鼻气管炎病毒基因组结构和典型蛋白功能
        1.2 牛鼻气管炎病毒的分型
        1.3 牛鼻气管炎的致病机理
            1.3.1 牛鼻气管炎的侵染过程
            1.3.2 牛鼻气管炎的潜伏感染
        1.4 牛鼻气管炎的流行现状
    2 牛鼻气管炎的诊断与防控
        2.1 牛鼻气管炎的诊断
            2.1.1 病原学方面的检测手段
                2.1.1.1 包涵体染色镜检检查
                2.1.1.2 BHV-1病毒的分离与鉴定
                2.1.1.3 分子技术诊断BHV-1
            2.1.2 血清学检测
                2.1.2.1 中和试验检测
                2.1.2.2 间接血凝试验检测
                2.1.2.3 琼脂扩散试验检测
                2.1.2.4 酶联免疫吸附试验检测
        2.2 牛鼻气管炎的防控
        2.3 牛鼻气管炎疫苗的种类
            2.3.1 常规疫苗
                2.3.1.1 弱毒疫苗
                2.3.1.2 灭活疫苗
            2.3.2 新型疫苗
                2.3.2.1 亚单位疫苗
                2.3.2.2 DNA疫苗
                2.3.2.3 基因工程疫苗
    3 牛鼻气管炎基因工程疫苗的研制方法
        3.1 同源重组技术
        3.2 锌指核酸酶技术
        3.3 转录激活样效应物核酸酶技术
        3.4 Cre/LoxP系统
        3.5 CRISPR/Cas9系统
    4 结语
第二章 基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1 gE缺失株及其生物学特性初步鉴定
    前言
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 试剂耗材与实验仪器
                1.1.1.1 试剂
                1.1.1.2 耗材
                1.1.1.3 仪器
            1.1.2 细胞与病毒
        1.2 方法
            1.2.1 扩增gE基因并测序分析
            1.2.2 敲除载体的构建
            1.2.3 供体质粒的构建
            1.2.4 病毒PCR产物的回收纯化
            1.2.5 质粒DNA的提取
            1.2.6 细胞冻存与复苏
            1.2.7 筛选转染效率较高的细胞系
            1.2.8 不同细胞中毒价的测定
            1.2.9 荧光毒株与缺失毒株的拯救
            1.2.10 重组病毒的筛选与鉴定
            1.2.11 重组病毒的纯化与扩增
            1.2.12 病毒基因组DNA的提取
            1.2.13 病毒的生物学特性分析
                1.2.13.1 病毒效价的测定
                1.2.13.2 绘制病毒增殖曲线
            1.2.14 数据分析标准
    2 实验结果
        2.1 实验设计
        2.2 BHV-1 gE基因的流行性分析
        2.3 载体的构建与鉴定
            2.3.1 敲除载体的构建与鉴定
            2.3.2 供体质粒的构建与鉴定
        2.4 编辑BHV-1细胞系的筛选
            2.4.1 转染效率筛选
            2.4.2 病毒复制能力筛选
        2.5 重组病毒的筛选与纯化
            2.5.1 重组病毒的筛选与鉴定
            2.5.2 重组病毒的噬斑克隆纯化
        2.6 亲本毒与目的毒株生物学特性比较
            2.6.1 噬斑形成单位的测定与比较
            2.6.2 增殖曲线的绘制
    3 讨论
        3.1 细胞系的选择
        3.2 sgRNA的筛选
        3.3 重组病毒的筛选和外源蛋白的表达
    4 结论
参考文献
致谢
个人简历及硕士期间成果



本文编号：3838335