副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其外膜蛋白P2基因的生物信息学分析

发布时间：2023-10-18 20:17

　　本试验从疑似感染革拉泽氏病的猪肺脏、心包液、关节液等病料组织中分离出3株疑似副猪嗜血杆菌,并进行了药敏实验,获取对HPS分离株有较高敏感性的药物。采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌分离株的外膜蛋白P2基因并进行测序分析,结果显示4型分离株HS Ⅰ和HS Ⅱ分别与4型参考株SW124的核苷酸同源性为97.3%、97%,差异性为2.8%、3.1%,5型分离株HW Ⅰ与5型参考株nagasaki核苷酸同源性为2.9%。试验确定副猪嗜血杆菌的外膜蛋白P2基因具有高度保守性。 Ⅰ.副猪嗜血杆菌的分离鉴定 将于四川南充、遂宁等地采集的疑似感染革拉泽氏病的猪肺脏、心包液、关节液等病料组织,做无菌处理后将匀浆液接种液体培养基培养过夜,涂布固体培养基,挑取生物学特征与副猪嗜血杆菌相似的单个菌落接种固体培养基,分离出3株疑似副猪嗜血杆菌。经多次传代纯化后进行染色镜检、生化试验、药物敏感试验等微生物特性鉴定,随后经16SrDNA序列分析确定副猪嗜血杆菌。抗原抗体凝集实验鉴定出这3株分离菌分别为血清型4型、4型和5型。动物实验结果显示这3株菌都有很强的毒力。药敏试验表明HPS分离株对部分药物有较高的敏感性：氨基糖...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 副猪嗜血杆菌研究进展
        1.1 副猪嗜血杆菌的生物学特性
            1.1.1 形态学特征
            1.1.2 理化特性
            1.1.3 培养特性
            1.1.4 血清型研究进展
        1.2 副猪嗜血杆菌的危害及防治
            1.2.1 流行病学
            1.2.2 副猪嗜血杆菌病的防治
        1.3 诊断方法
        1.4 毒力因子的研究现状
            1.4.1 主要毒力因子及其致病机制
            1.4.2 外膜蛋白的相关研究
        1.5 生物信息学研究进展
            1.5.1 生物信息学产生背景及发展现状
            1.5.2 生物信息学的研究课题
            1.5.3 研究意义
    2 实验目的及意义
第二章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定与耐药性检测
    1 实验材料
        1.1 病料来源
        1.2 实验动物
        1.3 主要试剂
        1.4 主要溶液的配制
        1.5 主要培养基及其配制
        1.6 PCR鉴定的引物设计合成
        1.7 主要实验器材
    2 实验方法和步骤
        2.1 病原菌分离纯化
        2.2 分离株的微生物特性
            2.2.1 细菌形态观察
            2.2.2 NAD试验
            2.2.3 CAMP试验
            2.2.4 生化试验
            2.2.5 药敏试验
        2.3 16SrDNA PCR方法的鉴定
        2.4 血清型鉴定
        2.5 HPS菌株保种
        2.6 致病性试验
            2.6.1 活菌计数
            2.6.2 动物接种
    3 结果分析
        3.1 病死猪的临床症状及剖检病理变化
        3.2 细菌的分离培养及微生物特性
        3.3 生化实验鉴定结果
        3.4 药敏试验
        3.5 16SrDNA PCR鉴定
        3.6 血清型鉴定
        3.7 致病力试验
    4 讨论与结论
第三章 副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆
    1 实验材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 主要试剂
        1.3 培养基的制备
        1.4 主要溶液的配制
        1.5 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 副猪嗜血杆菌外膜蛋白ompP2基因的PCR扩增
            2.1.1 引物设计与合成
            2.1.2 HPS菌种复苏
            2.1.3 ompP2基因的PCR扩增
            2.1.4 PCR扩增产物电泳检测
        2.2 目的基因的克隆
            2.2.1 ompP2基因PCR产物纯化回收
            2.2.2 CaCl₂法制备DH5α感受态细胞的制备
            2.2.3 PCR纯化产物与T载体的连接
            2.2.4 重组质粒转化感受态细胞
            2.2.5 PCR产物重组质粒的鉴定
    3 结果与分析
        3.1 ompP2基因PCR扩增结果
        3.2 pMD-ompP2重组质粒的构建结果
        3.3 重组质粒双酶切鉴定结果
    4 讨论
第四章 副猪嗜血杆菌ompP2基因的生物信息学分析
    1 实验材料
        1.1 菌株
        1.2 主要生物信息学分析软件
    2 方法
        2.1 序列测定
        2.2 ompP2基因的核苷酸序列同源性和进化树分析
        2.3 ompP2成熟蛋白的氨基酸序列推导及其同源性和进化树分析
        2.4 ompP2成熟蛋白的跨膜区、表面性、亲水性与抗原性预测
        2.5 ompP2成熟蛋白二级结构预测
    3 结果分析
        3.1 开放阅读框(ORF)特征
        3.2 ompP2基因的信号肽分析结果
        3.3 推导的ompP2成熟蛋白的氨基酸序列
        3.4 同源性和进化树分析结果
        3.5 ompP2成熟蛋白的跨膜区、表面性、亲水性与抗原性预测结果
        3.6 plpE成熟蛋白二级结构预测结果
    4 讨论
        4.1 关于生物信息学
        4.2 ompP2基因的分子特性分析
结论
参考文献
致谢
附录



本文编号：3855124